시작하려면 실내 조명을 끄십시오. FlowView 소프트웨어의 안구 패널에서 안구를 선택합니다. 큐브 터렛을 4개의 TRITC로 변경하고 소프트웨어에서 터치 패널 컨트롤러의 백라이트 아래에서 끄기를 클릭하여 터치 패널 컨트롤러를 끕니다.
그런 다음 컴퓨터 화면을 끕니다. 현미경의 검은색 천 덮개의 앞면을 엽니다. 블랙 박스에서 배아가 들어있는 35mm 유리 바닥 접시를 가져 와서 현미경 무대에 놓습니다.
그런 다음 형광 조명 장치를 켜고 접안렌즈를 사용하여 관심 있는 배아를 식별합니다. 초점을 맞춥니다. 검은 천 덮개를 닫아 s를 보호하십시오.amp빛으로부터.
컴퓨터 화면을 켜서 현미경을 제어하는 소프트웨어에 액세스합니다. 이미지 획득을 위해 소프트웨어에서 접안렌즈를 LSM으로 변경합니다. 25배 배율의 Water Immersion Objective를 사용하여 자극되지 않은 배아를 제어하여 레이저 절제를 수행합니다.
도구 창에서 밝은 Z(Bright Z), 시퀀스 매니저(Sequence Manager) 및 LSM 자극(LSM stimulation)을 클릭합니다. 스캐너 유형을 Galvano로 설정하고 스캔 크기를 512 x 512로 설정합니다. PMT 설정 패널에서 채널 1과 채널 3을 켜서 1040 나노미터 레이저를 사용할 수 있도록 하고 라이브 4배 속도를 클릭하여 배아를 시각화합니다.
회전 기능을 사용하여 배아를 회전시켜 전방 후축이 수직 방향이 되도록 하고 확대/축소를 3으로 설정합니다. 스캔 설정에서 모양 도구를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 그리고 참조 패널에서 ROI 크기를 설정합니다. 그런 다음 ROI를 너비 512픽셀, 높이 100픽셀로 설정합니다.
절제 전 Z 스택에 대한 획득 파라미터를 설정하려면 Z 섹션 아래에 배아의 표면을 0으로 등록합니다. 시작을 0으로 설정하고 끝을 100마이크로미터로 설정합니다. 스텝 크기를 2마이크로미터로 설정하고 계열 탭에서 Z를 선택하여 Z 획득 모드를 활성화합니다.
밝은 Z 기능을 사용하여 1040나노미터 레이저 강도를 3%에서 7%까지 선형으로 증가시키도록 설정시퀀스 관리자에서 LSM을 클릭하여 파이프라인의 첫 번째 작업으로 현재 이미징 설정을 저장합니다. 절제 전 동영상에 대한 획득 매개변수를 설정하려면 이전에 설명한 대로 배아의 복부 표면 근처에서 512 x 512픽셀의 ROI를 설정합니다. 1, 040 나노 미터 레이저 강도를 3 % 체크 타임으로 설정하고 시리즈 패널에서 Z를 선택 취소하십시오.
타임랩스 패널에서 간격을 자유 실행으로 유지하고 주기를 10으로 설정합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 LSM(LSM)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다. 레이저 절제에 대한 파라미터를 설정하려면 바이텔린 멤브레인 바로 아래에 3D 영역을 정의합니다.
Z 스택의 시작을 평면으로 설정하고 끝을 20마이크로미터 깊이로 설정합니다. 스텝 크기를 1.5마이크로미터로 설정합니다. PMT 설정 패널에서 채널 2와 채널 4를 켜서 920 나노미터 레이저를 사용할 수 있도록 합니다.
레이저의 강도를 30%로 설정하고 정의된 3D 영역 내에서 단일 Z 스택에 대해 레이저로 이미지 획득을 설정합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 LSM(LSM)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다. 절제 후 영상에 대한 획득 파라미터를 설정하려면 1, 040 및 920 나노미터 레이저를 사용하여 100 프레임 단일 Z 평면 절제 후 영상에 대한 이미지 획득을 설정합니다.
레이저의 강도를 3% 및 0.3%로 설정시퀀스 관리자에서 LSM을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다. 획득에서 시퀀스를 선택합니다. 필요에 따라 데이터 저장 경로와 파일 이름을 변경합니다.
ready(준비)를 클릭하고 소프트웨어가 파이프라인을 초기화할 때까지 기다린 다음 start(시작)를 클릭하여 파이프라인을 실행합니다. 자극된 배아에서 레이저 절제를 수행하기 위해, 자극되지 않은 배아에 대해 시연된 대로 절제 전 Z 스택에 대한 획득 매개변수를 설정합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 LSM(LSM)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 첫 번째 작업으로 저장합니다.
정의된 ROI 내에서 광유전학적 자극에 대한 매개변수를 설정하려면 확대/축소를 1로 변경하고 배아의 복부 표면을 덮는 ROI를 선택합니다. 채널 1에서 채널 4 감지기를 끄고, LSM 자극을 클릭하고, 지속 시간 내에서 연속을 선택 취소하고, 12초를 입력합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 자극(stimulation)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다.
자극 후 3분의 대기 시간을 설정하여 미오신 및 정점 F-액틴 분해의 완전한 비활성화를 보장하고 레이저 절제 전에 정적 조직 형태를 달성합니다. 다음으로, 1, 040 및 920 나노미터 레이저가 이미지 획득에 사용된다는 점을 제외하고, 자극되지 않은 배아에 대해 입증된 바와 같이 단일 Z 평면 사전 절제 필름에 대한 획득 파라미터를 설정합니다. 채널 1에서 채널 4 감지기를 켭니다.
레이저의 강도를 3% 및 0.3%로 설정시퀀스 관리자에서 LSM을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다. 자극되지 않은 배아에 대해 입증된 대로 레이저 절제에 대한 매개변수를 설정합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 LSM(LSM)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다.
자극되지 않은 배아에 대해 시연된 대로 절제 후 단일 Z 평면 영화에 대한 획득 매개변수를 설정합니다. 시퀀스 관리자(Sequence Manager)에서 LSM(LSM)을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다. 획득에서 시퀀스를 선택합니다.
필요에 따라 데이터 저장 경로와 파일 이름을 변경합니다. ready(준비)를 클릭하고 소프트웨어가 파이프라인을 초기화할 때까지 기다린 다음 start(시작)를 클릭하여 파이프라인을 실행합니다. 정점 수축을 겪고 있는 자극되지 않은 배아에서 스파게티 스쿼시 mCherry는 내측 정점 영역에서 풍부해진 반면, CRY2Rho 하나의 우세한 음성 mCherry는 세포질이었습니다.
자극된 배아에서 CRY2Rho 하나의 우세한 음성 mCherry 신호는 원형질막에 국한된 반면, 스파게티 스쿼시 mCherry의 내측 정점 신호는 완전히 사라졌습니다. 수축 영역 내에서 자극되지 않은 배아의 레이저 절제는 전방 후방 축을 따라 빠른 조직 반동을 일으킨 반면, 자극된 배아의 레이저 절제는 눈에 띄는 조직 반동을 일으키지 않았습니다. 절제를 정량화하여 여기에 표시했습니다.
