Mounting and Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain

세 번째 instar 유충 뇌의 생세포 이미징을 수행하려면 해부된 뇌와 분리된 지방체를 해부 및 이미징 배지가 들어 있는 3웰 해부 접시의 마지막 웰에 수집하는 것으로 시작합니다. 슬라이드 뒷면에 가스 투과성 멤브레인을 놓고 분할 링을 중앙으로 누릅니다. 200 마이크로 리터 마이크로 피펫을 사용하여 가능한 최대 지방체와 130-140 마이크로 리터의 배지를 가진 최대 10 개의 해부 된 뇌를 멤브레인 중앙으로 옮깁니다.

이미징할 신경 줄기 세포 집단과 현미경 유형에 따라 뇌의 방향을 지정하여 샘플이 현미경의 대물렌즈에 가까운지 확인합니다. 예를 들어, 중심 뇌엽의 신경 줄기 세포를 이미지화하려면 뇌엽이 대물렌즈에 가장 가까운지 확인하십시오. 그런 다음 멤브레인의 용액 위에 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓아 멤브레인 전체에 뇌와 지방체와 함께 용액을 퍼뜨립니다.

뇌가 찌그러지지 않고 커버 슬립에 닿을 때까지 과도한 용액을 닦아내기 위해 커버 슬립 가장자리에서 실험실 조직을 잡습니다. 다음으로, 페인트 브러시를 사용하여 가장자리를 따라 용융 바셀린을 바르고 젤리가 굳도록 하여 커버 슬립을 고정합니다. 400 마이크로리터의 이미징 매체를 멀티 웰 마이크로 슬라이드의 웰에 추가합니다.

이전에 해부 된 뚱뚱한 시체를이 우물로 옮깁니다. 그런 다음 우물 중앙 근처의 클러스터에 최대 10개의 뇌를 놓습니다. 이미지화할 신경 줄기 세포 집단과 현미경 유형에 따라 뇌의 방향을 지정합니다.

뇌가 2-5 분 동안 우물에 정착하도록하십시오. 마이크로 슬라이드를 현미경으로 옮기기 전에 슬라이드 덮개로 덮으십시오. 사진 표백을 최소화하기 위해 가장 낮은 레이저 출력과 노출 시간을 사용하여 획득 프로세스를 시작합니다.

UAS 구동 Cherry-Jupiter 및 양성 태그가 지정된 핀 GFP를 발현하는 유충 뇌의 이미징은 다중 웰 이미징 슬라이드를 사용하고 지방체 보충 없이 핀이 유사분열 방추체가 유사분열 동안 일관되게 정렬되는 분열 신경아세포에서 뚜렷한 정점 초승달 모양을 형성한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 샘플에서 세포 주기 길이는 이미징 시간이 증가함에 따라 증가했습니다. 멤브레인 결합 슬라이드의 지방체 보충 배지에서 이미지화된 샘플은 세포 주기 길이의 증가를 나타내지 않았습니다.

또한, 4개의 분열을 가진 신경아세포가 10시간 막 결합 슬라이드에서 관찰되었습니다.