시작하려면 미리 앉은 24 웰 배양 플레이트를 가져 와서 각 웰에 유리 덮개 슬립을 놓습니다. 그런 다음 10% FBS 및 DMEM을 포함하는 800마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다. 세포 농도를 조절한 후.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양액을 버리고 PBS로 세포를 세척합니다. BSA를 함유하는 800 마이크로리터의 DMEM 유도 배지에 세포를 현탁시킨다.
리놀레산을 무수 에탄올에 용해시켜 리터당 100 밀리몰의 농도로 표준 용액을 제조한다. 리놀레산을 플레이트에 그라디언트를 증가시키고 4 번 반복하십시오. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척한다. 400 마이크로 리터의 4 % 파라 폼 알데히드로 20 분 동안 고정하십시오. 그런 다음 정착액을 버리고 다시 씻으십시오.
세포를 60% 이소프로필 알코올로 5분 동안 배양한 다음 버립니다. 갓 준비한 오일 레드 O 작업 용액을 넣고 20-30 분 후에 버립니다. 과량의 염료 용액이 제거될 때까지 PBS로 세포를 2 내지 5회 세척한다.
300 마이크로 리터의 헤마 톡실 린 용액으로 1-2 분 동안 핵을 재 염색하십시오. 그런 다음 염료 용액을 버리고 다시 씻으십시오. PBS 세척 플레이트에서 유리 커버 슬립을 제거하고 10 마이크로리터의 정제 실란트가 들어 있는 미세한 슬라이드 위에 세포가 아래를 향하도록 놓습니다.
LD의 크기와 수를 측정하려면 컴퓨터와 현미경 스위치를 연속적으로 켜고 슬라이드를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다. 저전력에서 이미지를 찾고 이미징 슬라이드에 적절한 양의 삼나무 오일을 떨어 뜨립니다.
대물렌즈를 200배 점진적으로 조정하고 시야를 조정합니다. 그런 다음 원하는 영역에서 이미지를 캡처하고 저장합니다. 각 이미지에 대해 무작위로 60개의 LD를 선택하고 직경을 측정합니다.
측정 결과를 표로 내보내 LD의 평균 크기와 분포 비율을 분석합니다. 염색된 간세포 배양 세포는 LD의 크기와 수가 다른 것으로 나타났습니다. 리놀레산 처리의 다른 농도의 하에서.
세포당 LD의 수는 리놀레산의 농도에 따라 음의 상관관계가 있었다. 세포당 중앙값 LD 수는 리터당 100마이크로몰의 리놀레산 처리군에서 136이었고 고농도에서 감소했습니다. 대조군에서 LD의 평균 직경은 0.72 마이크로미터였으며, 이는 리놀레산 처리군에서 농도가 증가함에 따라 증가하였다.
리놀레산 농도가 높을수록 큰 LD의 비율이 증가하고 작은 LD가 감소합니다.
