얼음 위의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 10 마이크로 리터의 무 세포 추출물과 4 마이크로 그램의 플라스미드 DNA 및 25 마이크로 리터의 2X 무 세포 단백질 합성 완충액을 결합합니다. 이중 증류수로 총 부피 50 마이크로리터를 만들어 무세포 단백질 합성 용액을 제조한다. 0.75 그램의 아가로스를 칭량하고, 이를 100 밀리리터의 이중-증류수 완충액에 첨가하여 0.75% 아가로스를 제조한다.
마이크로파는 0.75% 아가로스를 고출력에서 30초 동안 파열하고, 용융된 아가로스의 50 마이크로리터를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브 또는 원하는 모양의 몰드에 피펫팅한다. 용융된 아가로스를 섭씨 50도로 설정된 열 블록 상에 놓고, 아가로스가 냉각되나 중합되지 않도록 한다. 이어서, 용융된 아가로스를 무세포 단백질 합성 용액과 피펫팅하고 피펫 팁으로 교반하여 혼합한다.
겔을 실온으로 식히고 약 2분 동안 중합합니다. 중합된 아가로스를 주걱으로 1.5-밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 액체 질소에서 플래시 동결시킨다. 급속 냉동 하이드로겔을 섭씨 영하 80도의 보관 장소에 1시간 동안 보관합니다.
그런 다음 미세 원심 분리기 튜브 뚜껑을 제거하십시오. 튜브를 왁스 필름으로 덮고 필름을 뚫어 수분이 건조되도록 합니다. 동결 건조기의 온도를 섭씨 영하 20도, 압력을 0.1밀리바로 설정하고 무세포 단백질 합성 장치를 18시간 또는 하룻밤 동안 동결 건조합니다.
동결건조 장치를 과량의 액체 없이 50 마이크로리터의 이중 증류수로 30분 동안 재수화시키고, 주걱을 사용하여 겔을 흑색 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. 마지막으로 마이크로타이터 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 형광 검출 및 분석을 위해 화면에 표시된 플레이트 리더 설정을 사용합니다. E.coli 세포 용해물을 사용한 하이드로겔에서 eGFP 및 mCherry의 cell-free 단백질 합성이 이 그림에 나와 있습니다.
0.75% 아가로스 겔은 4마이크로그램의 eGFP 또는 mCherry 템플릿 또는 4마이크로그램의 eGFP 및 mCherry 템플릿을 사용하여 DNA 템플릿 없이 제조되었습니다. 두 채널의 오버레이도 표시되며 오버레이에는 차동 간섭 대비 이미지가 포함됩니다. 그 결과 아가로스에서 mCherry와 eGFP의 동시 발현이 확인되었습니다.
