플라스미드를 함유하는 아데노 관련 ITR에서 관심 유전자를 클로닝한 후, 10% FBS가 보충된 예열된 DMEM을 사용하여 6웰 플레이트에 10개에서 5번째 세포까지 3번 파종합니다. 세포가 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 자라도록 하여 75-90%의 합류점을 얻습니다. 다음으로, 100밀리그램의 폴리에틸렌에민 염산염 또는 PEI 맥스를 증류수 100밀리리터에 녹여 마이크로리터 스톡당 1마이크로그램을 만듭니다.
수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.1로 조정합니다. 그런 다음 0.22 마이크로 미터 필터를 사용하여 혼합물을 살균하고 시약을 섭씨 4도에서 한 달 동안 보관하십시오. 2 밀리리터 튜브에 1.3 마이크로그램 rep/cap 플라스미드, 플라스미드를 함유한 1.3 마이크로그램 ITR, 2.6 마이크로그램의 아데노바이러스 도우미 플라스미드를 혈청이 없는 DMEM에 추가합니다.
이 혼합물의 총 부피는 100 마이크로 리터이어야합니다. 별도의 튜브에 negative control을 준비하고, rep/cap plasmid를 관련 없는 plasmid로 교체합니다. 이제 5.2 마이크로리터의 PEI max를 플라스미드 혼합물에 첨가합니다.
이것은 동일한 플라스미드 대 PEI 비율을 유지합니다. 7로 설정된 와류 믹서에서 10-15회 부드럽게 와류합니다. 다중 벡터의 경우, 후속 단계에서 충분한 시간 동안 1분 간격으로 PEI 덧셈을 엇갈리게 합니다.
실온에서 정확히 15분 동안 각 튜브를 배양합니다. 그런 다음 1.9mL의 무혈청 DMEM을 첨가하여 반응을 희석하여 최종 부피 2mL를 얻습니다. 내용물을 섞기 위해 부드럽게 두 번 피펫팅합니다.
우물에서 매체를 흡입합니다. 세포 분리를 방지하기 위해 플라스미드 PEI 혼합물을 웰 측면에 조심스럽게 추가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 형질주입된 세포의 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 얼리고 섭씨 37도에서 30분 동안 해동합니다.
이 사이클을 총 3회 반복합니다. 층류 후드에서 세포를 효과적으로 파괴하기 위해 피펫팅을 통해 각 웰을 무균 상태로 혼합합니다. 용해물을 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.
15, 실온에 15 분 동안 000 G에 분리기 세포 파편을 제거하고 새로운 2 밀리리터 관에 주의깊게 상층액을 옮기고 4 섭씨 온도에 관을 저장하십시오. 다음으로, 원하는 세포 유형을 96웰 플레이트에 도금하고 형질도입 기간에 따라 50-75%의 표적 밀도를 위해 배양합니다. 다음 날, transduction에 필요한 최적의 벡터 양을 얻기 위해 혈청이 없는 배지에서 조제 제제를 1-3회 희석합니다.
그런 다음 96웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 50 내지 100마이크로리터의 희석된 원유 제제를 웰에 첨가합니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 형질 주입 효율을 결정하기 위해 형질 주입 후 48시간에 형광 현미경을 사용하여 형광 리포터의 발현을 관찰합니다.
추가 분석을 위해 벡터를 제거하고 미리 예열된 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 마지막으로 10분 동안 4% 파라포름알데히드에 세포를 고정하여 형질도입을 종료합니다. 형질도입 효율 데이터는 AAV2 및 KP1이 테스트된 모든 세포주에서 가장 강력한 혈청형임을 시사했습니다.
HEPA1-6은 Huh7에 비해 형질도입이 현저히 감소했다. AAV2는 미분화 HSKMC 근아세포와 분화된 HSKMC 근관을 효율적으로 transduction했습니다. 다양한 배지 조건이 형질도입 중에 중요한 역할을 합니다.
pre-transduction 배지에서 배양된 마우스 소장 오가노이드는 오가노이드 성장 배지에서 배양된 오가노이드에 비해 덜 효과적으로 transduction되었습니다.
