안락사된 쥐를 구부러진 집게를 사용하여 눈 주위의 조직을 눌러 눈구멍에서 눈을 빼내는 것으로 시작합니다. 그런 다음 눈을 들어 올려 제거하고 해부 트레이의 새 PBS로 옮깁니다. 초극세 가위를 사용하여 시신경을 안구에 최대한 가깝게 자르고 눈 뒤쪽의 시신경 출구를 통해 미세한 끝 직선 핀셋을 안구에 조심스럽게 삽입합니다.
이제 눈의 뒤쪽에 가위를 삽입하고 뒤쪽에서 각막 공막 접합부를 향해 절개를 시작하고 접합부의 절반이 분리될 때까지 절개를 계속합니다. 수정체가 절개 부위를 통해 나올 수 있도록 각막을 부드럽게 누릅니다. 끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈에서 큰 티슈 조각을 조심스럽게 제거합니다.
적도 지역을 찾은 후 렌즈를 얕게 뚫고 렌즈 캡슐을 제거합니다. 수정체 섬유 세포를 1% 파라포름알데히드가 있는 60mm 접시에 옮깁니다. 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 섬유 세포의 공을 반으로 나눕니다.
그런 다음 같은 축을 따라 반쪽을 더 잘라 4분의 1을 만듭니다. 직선 핀셋을 사용하여 렌즈 섬유 셀 쿼터에서 핵 영역을 제거합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 1 % 파라 포름 알데히드를 48 웰 플레이트에 추가합니다.
수정체 피질을 플레이트로 옮기고 300RPM에서 부드럽게 흔들면서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 차단 후 적절한 1차 항체를 48웰 플레이트에 추가하고 샘플을 1차 항체 용액으로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 흔들거나 돌연변이를 일으켜 배양합니다.
다음날 PTX로 샘플을 세척하고 마찬가지로 2차 항체로 배양합니다. 샘플을 세척한 후 한 방울 또는 50마이크로리터의 장착 매체를 플러스 충전 현미경 슬라이드에 추가합니다. 장착 매체에 티슈를 넣습니다.
그리고 핀셋을 사용하여 섬유 세포를 서로 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 분리된 셀과 장착 매체 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 과도한 매체를 제거한 후 매니큐어를 사용하여 컨포칼 현미경 검사 전에 슬라이드의 커버 슬립 가장자리를 밀봉합니다.
수정체를 절개하고 수정체를 제거한 후 섬유 세포 덩어리를 장갑을 낀 젖은 손가락 끝으로 옮기고 모든 방향으로 부드럽게 굴려 수정체 핵을 분리합니다. 그런 다음 수정체 핵을 48웰 플레이트에서 갓 만든 1% 파라포름알데히드 용액에 옮기고 섭씨 4도에서 부드럽게 흔들거나 돌연변이를 일으켜 밤새 배양합니다. 다음 날, 샘플을 1% 파라포름알데히드가 있는 60mm 접시에 옮기고 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 수정체 핵을 반으로 나눈 다음 4등분합니다.
그런 다음 이전에 시연된 대로 샘플을 접미사, 차단, 염색 및 장착합니다 이러한 준비에서는 고유한 형태를 가진 렌즈 섬유 세포 다발이 다양한 렌즈 영역에서 발견됩니다. F-액틴 네트워크의 염색은 분화 및 성숙 섬유의 세포막에서 농축을 보여주는 반면 F-액틴 신호는 핵섬유의 세포질에 존재합니다. 분화 섬유 세포의 주사 전자 현미경 및 공초점 이미지는 작은 맞물리는 돌출부가 있는 볼 및 소켓 간극을 보여주는 반면, 성숙한 섬유에는 작은 돌출부로 장식된 패들이 있습니다.
핵렌즈 섬유 세포의 주사 전자 현미경 및 컨포칼 현미경 이미지는 세포막이 거칠고 렌즈 중앙에서 이러한 세포에 혀와 홈이 있는 세포의 짧은 면에 드물고 더 큰 맞물리는 돌출부를 보여줍니다.
