이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute)의 보조금 R01 EY032056(to CC)의 지원을 받았습니다. 저자들은 전자 현미경 이미지에 도움을 준 Scripps Research Core Microscopy Facility의 Theresa Fassel 박사와 Kimberly Vanderpool 박사에게 감사를 표합니다.

생쥐는 인디애나 대학교 블루밍턴(Indiana University Bloomington)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 관리되었습니다. 대표 데이터를 생성하는데 사용된 마우스는 C57BL6/J 배경의 대조군(야생형) 동물, 암컷, 생후 8-12주였다. 수컷과 암컷 쥐 모두 이 실험에 사용할 수 있는데, 이는 생쥐의 성별이 실험 결과에 영향을 미칠 가능성이 매우 낮기 때문이다.
1. 렌즈 해부 및 디캡슐레이션
<ol><li>미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"와 해당 기관에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다. 참고: 본 연구에서 마우스는 승인된 동물 프로토콜(인디애나 대학교)에 따라 CO2 과다 투여 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다.</li>
	<li>곡선형 집게를 사용하여 눈의 한쪽 면으로 눈 주위 조직을 눌러 눈을 소켓 밖으로 빼내어 쥐의 눈을 적출시킵니다. 그런 다음 눈 밑에 있는 집게를 닫고 들어 올려 소켓에서 눈을 제거합니다. 눈을 해부 트레이에 있는 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮깁니다.</li>
	<li>초극세 가위로 시신경을 안구에 최대한 가깝게 자릅니다. 끝이 가늘고 곧은 핀셋을 눈 뒤쪽에 있는 시신경의 출구를 통해 안구에 조심스럽게 삽입합니다.</li>
	<li>1.3단계에서 핀셋과 같은 위치에 가위를 조심스럽게 삽입하고 후방에서 각막-공막 접합부를 향해 절개를 시작합니다. 알림: 설치류 렌즈는 눈의 ~30%를 차지합니다. 핀셋이나 가위를 눈에 너무 깊숙이 삽입하면 우발적인 손상이 발생합니다.</li>
	<li>접합부의 절반 이상이 분리될 때까지 각막-공막 접합부를 따라 계속 절단합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 각막을 부드럽게 눌러 수정체가 1.4단계와 1.5단계로 만든 절개를 통해 나올 수 있도록 합니다.</li>
	<li>끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈에서 큰 조직 조각을 조심스럽게 제거합니다. 렌즈를 검사하여 적도 지역을 찾으십시오.</li>
	<li>끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈를 얕게 뚫은 다음 렌즈 캡슐을 제거합니다. 수정체 섬유 세포의 질량은 그대로 유지되고 수정체 상피 단층은 수정체 캡슐에 부착된 상태로 유지됩니다. 렌즈 캡슐을 폐기하십시오.</li>
</ol>2. 렌즈 단일 섬유 세포 염색
<ol><li>렌즈 섬유 세포 덩어리를 500μL의 갓 만든 1% 파라포름알데히드(PFA, 1x PBS) 용액이 있는 웰 플레이트에 옮기고 부드러운 너트레이션으로 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다(그림 2A). 참고: 주어진 용액의 부피는 48웰 플레이트에 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 웰 플레이트 또는 튜브를 사용하는 경우 그에 따라 용액의 부피를 조정하십시오. 고정, 차단 및 세척(1x PBS에서 1x PTX, 0.1% Triton X-100) 용액을 10x PBS와 이중 증류수(ddH2O)로 최종 농도 1x PBS로 만들었습니다.</li>
	<li>렌즈 섬유 셀을 PFA가 1%인 60mm 접시에 옮깁니다. 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 섬유 세포 공을 반으로 나눕니다(그림 2B). 같은 축을 따라 반을 다시 반으로 잘라 4등분합니다. 참고: 전방-후방 축은 조직 덩어리에서 섬유 세포의 방향에 의해 쉽게 인식됩니다.</li>
	<li>직선 핀셋을 사용하여 렌즈 fiber cell quarters에서 핵 영역을 제거합니다(그림 2C). 참고: 설치류 렌즈에서 수정체 핵 영역은 단단하며 수정체의 중심은 부드러운 피질 섬유에서 쉽게 분리됩니다.</li>
	<li>수정체 피질 영역의 4분의 1을 실온(RT)에서 15분 동안 1% PFA 200μL로 부드럽게 흔듭니다(플레이트 셰이커에서 300rpm).</li>
	<li>750μL의 1x PBS에서 각각 5분 동안 RT에서 부드럽게 흔들면서 조직 4분의 2를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>200μL의 차단 용액(5% 혈청, 0.3% Triton X-100, 1x PBS)을 사용하여 RT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 샘플을 차단합니다. 참고: 이 프로토콜의 대표 데이터의 경우, 샘플은 1차 또는 2차 항체로 염색되지 않았습니다. 블로킹 단계 후, 샘플을 밀 배아 응집체(WGA; 1:100) 및 팔로이딘(1:100)(재료 표 참조)으로 RT에서 3시간 동안 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하면서 배양했습니다. 1차 항체 염색은 이전 간행물22,23에서 입증되었습니다.</li>
	<li>100 μL의 1차 항체 용액을 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다. 참고: 항체는 차단 용액에 희석됩니다. 조직 절편이 있는 슬라이드와 비교할 때 이러한 유형의 준비에는 더 많은 세포가 있습니다. 더 많은 세포를 염색할 수 있는 충분한 항체를 제공하기 위해 1차 항체 농도를 높여야 합니다. 조직 절편에 사용되는 항체 농도를 두 배로 늘리는 것이 좋습니다. 2차 항체도 마찬가지다.</li>
	<li>1x PTX(0.1% Triton X-100, 1x PBS)로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 티슈 쿼터를 세 번 세척합니다.</li>
	<li>섬유 세포를 100μL의 2차 항체/염료 용액으로 실온에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 이 단계와 후속 단계에서 빛을 차단하십시오. 참고: WGA, 팔로이딘 및 기타 형광 염료를 2차 항체 용액에 첨가하여 세포막, 세포골격 또는 기타 세포 기관을 동시에 라벨링하는 동시에 1차 항체를 라벨링할 수 있습니다.</li>
	<li>섬유 셀을 1x PTX로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 4번 세척합니다.</li>
	<li>조직 쿼터를 슬라이드로 옮기기 전에 플러스 충전 현미경 슬라이드에 한 방울 또는 50μL의 장착 매체를 추가합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 섬유 세포를 서로 부드럽게 분리하고 세포 다발의 겹침을 제한하십시오.</li>
	<li>마운팅 미디어의 샘플 위에 #1.5 커버슬립을 부드럽게 적용합니다. 장착 미디어는 커버슬립의 가장자리까지 퍼져야 합니다. 이것이 발생하지 않으면 커버슬립의 가장자리에 추가 장착 미디어를 추가하십시오. 커버슬립 가장자리 주위에 있는 과도한 장착 매체를 흡입하고 매니큐어를 사용하여 슬라이드의 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다. 참고: 컨포칼 현미경 검사용으로 제조된 모든 유형의 장착 매체를 이러한 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 수정체 핵 단일 섬유 세포 염색
<ol><li>섹션 1에 설명된 해부를 완료합니다.</li>
	<li>수정체 섬유 세포의 볼에서 피질 섬유를 기계적으로 제거하고, 수정체핵을 남겨두고, 섬유 세포 덩어리를 젖은 장갑을 낀 손가락 끝으로 부드럽게 옮기고 조직 덩어리를 부드럽게 굴립니다. 참고: 마우스 렌즈에서 장갑을 낀 손가락 끝 사이로 수정체 섬유 세포의 볼을 굴리는 것은 경질 수정체 핵(28,30)에서 피질 섬유 세포를 제거하는 효과적인 방법입니다. 이러한 기계적 방법이 효과적이지 않은 렌즈의 경우, 피질 섬유 세포를 제거하기 위해 신중한 해부 또는 와류 방법(29)이 사용될 수 있다.</li>
	<li>렌즈 핵을 웰 플레이트에서 갓 만든 1% PFA 용액에 옮기고 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 PFA 1%가 함유된 60mm 접시에 옮기고 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 수정체 핵을 분할합니다. 조직 샘플을 다시 반으로 줄여 핵 분기를 생성합니다.</li>
	<li>2.4-2.13 단계에 설명된 과정을 따라 면역염색 및 검체 장착을 수행합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig02v2.jpg"> 그림 2: 렌즈 섬유 세포의 준비 및 면역염색을 자세히 설명하는 그래픽 요약 . (A) 이 48웰 플레이트는 설명된 방법에 대한 샘플 플레이트 설정을 보여주기 위해 컬럼별로 색상으로 구분되어 있으며, 겸자를 사용하여 부드럽게 취급하여 다양한 면역염색 단계 간에 샘플을 쉽게 이동할 수 있습니다. 이 프로토콜의 대표 데이터는 1차 항체로 배양되지 않지만, 다이어그램에는 1차 항체 배양을 위한 컬럼이 포함되어 있으며, 세척용 웰은 흡인에 의해 사용된 세척 완충액을 제거한 후 재사용할 수 있습니다. (B) 수정체 섬유 세포 덩어리를 고정한 후 세포의 원래 구조를 보존하기 위해 전후 축(빨간색 점선)을 따라 조직을 분할합니다. 조직 덩어리가 반으로 줄어들면 샘플이 회전하고 반쪽이 전방 후방 축(빨간색 점선)을 따라 4등분으로 나뉩니다. (C) 수정체 핵 영역(분홍색)을 제거하는 것은 핀셋을 사용하여 피질 섬유 세포(파란색)에서 조밀한 중앙 조직을 파내는 데 쉽게 수행됩니다. 카툰 다이어그램은 부분적으로 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Immunofluorescence Staining of Membrane Interdigitations in lens fiber cells(렌즈 섬유 세포의 막 간접 세포의 면역형광 염색)

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex.">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li><li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy.">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 렌즈의 다양한 깊이에서 번들 또는 단일 렌즈 섬유 세포의 3D 멤브레인 형태를 충실하게 보존하는 고정, 보존 및 면역염색 방법을 입증했습니다. 염색된 렌즈 섬유는 렌즈 섬유 세포 형태를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 온 SEM 제제와 비교됩니다. 결과는 두 제제 간의 유사한 멤브레인 구조를 보여줍니다. EM은 세포 형태 연구의 황금 표준으로 남아 있지만, 단백질33,34...

수정체는 눈의 전방에 있는 투명하고 난형적인 조직으로, 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성되어있습니다 1(그림 1). 수정체의 전방 반구를 덮고 있는 상피 세포의 단층이 있습니다. 섬유 세포는 상피 세포와 분화되어 수정체의 대부분을 구성합니다. 고도로 전문화된 섬유 세포는 수정체 주변부에서 수정체 중심까지 세포막 형태의 뚜렷한 변화를 특징으로 하는 신장, 분화 및 성숙 프로그래밍을 거칩니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 수정체 핵이라고도 합니다. 다양한 거리에서 망막으로 들어오는 빛의 초점을 미세하게 맞추는 수정체의 기능은 강성 및 탄성 13,14,15,16,17,18,19를 포함한 생체역학적 특성에 따라 달라집니다. 렌즈 섬유의 복잡한 interdigitations는 가설을 세웠으며20,21 최근에는 렌즈 강성(lens stiffness)22,23에 중요한 것으로 나타났습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg"> 그림 1: 렌즈 해부학적 구조와 렌즈 섬유의 대표적인 주사전자현미경(SEM) 이미지. 이 만화는 상피 세포의 전방 단층(하늘색으로 음영 처리)과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리(흰색)의 세로(위에서 아래로) 전방 단층을 보여줍니다. 수정체의 중앙(분홍색으로 음영 처리)은 핵으로 알려져 있으며 고도로 압축된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 오른쪽에는 단면 만화가 벌집 패턴으로 포장된 렌즈 섬유의 길쭉한 육각형 세포 모양을 보여줍니다. 섬유 전지에는 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 하단의 대표적인 SEM 이미지는 렌즈의 서로 다른 깊이에 있는 렌즈 섬유 셀 사이의 복잡한 막 삽입을 보여줍니다. 오른쪽부터 렌즈 주변부에 새로 형성된 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 있고 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있습니다(빨간색 상자). 성숙하는 동안 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부(파란색 상자)로 장식된 큰 패들 도메인을 발달시킵니다. 성숙한 섬유 세포는 작은 돌출부로 묘사된 큰 패들 도메인을 가지고 있습니다. 이러한 연동 영역은 렌즈의 생체역학적 특성에 중요합니다. 수정체핵의 섬유세포는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 적고 복잡한 혀와 홈이 있는 인터디지테이션(보라색 상자)이 있습니다. 세포의 넓은 면은 구형막 형태를 나타냅니다. 만화는22,32에서 수정되었으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. 스케일 바 = 3 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
수정체는 이전 세대의 섬유24,25 위에 겹쳐진 새로운 섬유 세포의 껍질을 추가하여 성장합니다. 섬유 전지는 길쭉한 육각형 단면 모양으로 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 이 세포는 수정체의 전방에서 후극까지 뻗어 있으며, 종에 따라 수정체 섬유의 길이는 수 밀리미터에 달할 수 있습니다. 이러한 길고 가느다란 세포의 구조를 지원하기 위해 넓은 면과 짧은 면을 따라 특수한 간지(interdigitation)가 맞물리는 구조를 만들어 수정체 모양과 생체역학적 특성을 유지합니다. 섬유 세포 분화 및 성숙 중 세포막 모양의 변화는 전자 현미경 (EM) 연구 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29에 의해 광범위하게 문서화되었습니다 . 새로 형성된 섬유 세포는 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있고 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있는 반면, 성숙한 섬유는 짧은 면을 따라 맞물리는 돌출부와 패들이 있습니다. 핵 섬유는 혀와 홈의 간지(tongue-and-groove interdigitations)와 구상막 형태(globular membrane morphology)를 나타낸다. 이러한 복잡한 맞물리는 막에 필요한 단백질에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 섬유 세포의 단백질 국소화에 대한 이전 연구는 복잡한 세포 구조를 명확하게 시각화할 수 없는 렌즈 조직 절편에 의존했습니다.
이 연구는 복잡한 형태를 보존하고 세포막과 세포질 내에서 단백질에 대한 면역염색을 허용하기 위해 수정체 섬유 세포의 단일 및 다발을 고정하는 새로운 방법을 만들고 완성했습니다. 이 방법은 EM 연구의 데이터와 비교할 수 있는 세포막 구조를 충실하게 보존하고 특정 단백질에 대한 1차 항체로 염색할 수 있습니다. 우리는 이전에 분화 및 성숙을 겪는 면역 염색 된 피질 수정체 섬유를 가지고 있습니다22,23. 이 프로토콜에는 수정체 핵에서 섬유 세포를 염색하는 새로운 방법도 있습니다. 이 프로토콜은 섬유 세포 성숙 및 수정체 핵 압축 중 막 삽입의 형성 및 변화를 위한 메커니즘을 이해할 수 있는 문을 열어줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >100% Triton X-100</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm plate</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X phosphate buffered saline</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1X phosphate buffered saline</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well plate</td>
			<td >CytoOne</td>
			<td >CC7672-7548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips (22 x 40 mm)</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-553-467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved tweezers</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >501981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >Stereo Discovery V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine tip straight tweezers</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >72707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail polish</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal donkey serum</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin (rhodamine)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary antibody</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11</td>
			<td >VWR</td>
			<td >76241-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibody</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight forceps</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#160;Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-565-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra-fine scissors</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wheat germ agglutinin (fluorescein)</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >FL-1021-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens

수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 모양을 바꾸어 빛을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 형성합니다. 이 조직의 대부분은 육각형 단면을 가지고 수정체의 전방에서 후방까지 뻗어 있는 전문적이고 분화된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 이 길고 가느다란 세포는 이웃 세포와 밀접하게 대립하며 세포의 길이를 따라 복잡한 간지(interdigitation)를 가지고 있습니다. 특수 연동 구조는 렌즈의 일반적인 생체역학적 특성에 필요하며 전자 현미경 기술을 사용하여 광범위하게 설명되었습니다. 이 프로토콜은 생쥐 렌즈 섬유 세포의 단수 및 다발을 보존하고 면역염색하여 복잡한 모양의 세포 내에서 단백질의 상세한 국소화를 가능하게 하는 첫 번째 방법을 보여줍니다. 대표적인 데이터는 수정체의 모든 영역에 걸쳐 말초, 분화, 성숙 및 핵 섬유 세포의 염색을 보여줍니다. 이 방법은 잠재적으로 다른 종의 렌즈로부터 분리된 섬유 세포에 사용될 수 있습니다.

수정체 섬유 세포는 수정체 피질(섬유와 성숙한 섬유를 분화)과 핵에서 제조되며, 세포는 F-액틴의 경우 팔로이딘으로, 세포막의 경우 WGA로 염색됩니다. 세포 다발 또는 단일 렌즈 섬유의 혼합물(그림 3)을 관찰하고 이미지화합니다. 수정체 피질에서 두 가지 유형의 세포가 발견됩니다(그림 3A). 수정체 주변부의 분화 섬유 세포는 직선이며 짧은 면을 따?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining at JoVE.com

저자 스포트라이트: Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining (복잡한 층간 이미징 및 단백질 염색을 위한 새로운 프로토콜을 통한 렌즈 생체역학 연구 발전) 

이 프로토콜은 복잡한 세포 간 간지화 및 막 구조를 연구하기 위해 면역형광 염색을 위해 말초, 성숙 및 핵 수정체 섬유 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 빛의 초점을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 만드는 역할을 합니다. 렌즈의 기능은 생체역학적 특성에 의존하며, 최근에는 렌즈 섬유 셀 사이의 복잡한 삽입이 수정체 강성에 중요한 것으로 나타났습니다. 수정체 섬유 세포의 특수한 형태는 이전에 전자 현미경으로 설명되었지만, 이러한 맞물리는 막에 필요한 단백질에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.이전 연구에서는 복잡한 세포 구조를 명확하게 시각화할 수 없는 수정체 조직 절편에 의존했습니다. 당사는 특정 단백질의 염색 및 공초점 현미경 이미징을 위해 렌즈 섬유 세포 사이의 복잡한 막 삽입을 충실하게 보존할 수 있는 새로운 기술을 만들고 완성했습니다. 이 프로토콜에는 수정체 핵이라고도 하는 수정체의 중심에서 섬유 세포를 염색하는 새로운 방법도 있습니다.이 방법은 막 간지의 형성 메커니즘과 변화를 연구함으로써 섬유 세포 분화 및 성숙을 이해할 수 있는 문을 열어줍니다.

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

1.3K 조회수.  Indiana University. 수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 빛의 초점을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 만드는 역할을 합니다. 렌즈의 기능은 생체역학적 특성에 의존하며, 최근에는 렌즈 섬유 셀 사이의 복잡한 삽입이 수정체 강성에 중요한 것으로 나타났습니다. 수정체 섬유 세포의 특수한 형태는 이전에 전자 현미경으로 설명되었지만, 이러한 맞물리는 막에 필요?...

비디오: 저자 스포트라이트: Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining (복잡한 층간 이미징 및 단백질 염색을 위한 새로운 프로토콜을 통한 렌즈 생체역학 연구 발전) 

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental pulp tissue, rich in the extracellular matrix, requires a long and tedious dissociation process that is typically beyond the reasonable time for single-cell transcriptomics. For avoiding artificial changes in gene expression, the time elapsed from euthanizing an animal until the analysis of single cells needs to be minimized. This work presents a fast protocol enabling to obtain single-cell suspension from mouse and human teeth in an excellent quality suitable for scRNA-seq (single-cell RNA-sequencing). This protocol is based on accelerated tissue isolation steps, enzymatic digestion, and subsequent preparation of final single-cell suspension. This enables fast and gentle processing of tissues and allows using more animal or human samples for obtaining cell suspensions with high viability and minimal transcriptional changes. It is anticipated that this protocol might guide researchers interested in performing the scRNA-seq not only on the mouse or human teeth but also on other extracellular matrix-rich tissues, including cartilage, dense connective tissue, and dermis.

The current protocol presents a fast, efficient, and gentle method for isolating single cells suitable for single-cell RNA-seq analysis from a continuously growing mouse incisor, mouse molar, and human teeth.

마우스와 인간의 치아에서 단일 세포의 신속한 격리

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Methods Article

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)