먼저 고해상도 호흡계를 켜서 장비를 준비하고 데이터 수집 및 분석을 위해 호흡 측정 소프트웨어 VatLab에 연결합니다. 산소 그래프 챔버의 70% 에탄올을 이중 증류수로 교체합니다. 자석 교반 막대를 사용하여 챔버에서 750RPM으로 계속 저어줍니다.
10분 동안 그대로 두었다가 물을 흡입합니다. 챔버를 이중 증류수로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 산소 센서를 교정하려면 먼저 이중 증류수와 피펫 2ml의 세포 준비 배지를 챔버로 제거합니다.
공기 교환 기포를 남기는 스토퍼를 놓습니다. 산소 보정 값을 기록하려면 센서의 게인, 편광 전압, 데이터 기록 간격과 같은 설정을 조정하십시오. 그런 다음 실험에 레이블을 붙이고 매체를 입력합니다.
레이아웃을 클릭하고 01 Calibration Experiment GR3 Temp를 선택합니다. 섭씨 37도에서 750RPM의 교반 막대로 매체를 30분 이상 저어주고 센서 멤브레인의 성능을 모니터링합니다. 마우스 왼쪽 버튼과 Shift 키를 누른 상태에서 마우스를 끌어 산소 농도 변화가 안정적인 영역을 선택합니다.
그런 다음 oxygraph를 클릭한 다음 O2 보정을 클릭합니다. 공기 보정에서 선택한 표시를 이전에 선택한 지역으로 변경합니다. 그런 다음 보정을 클릭하고 클립보드에 복사합니다.
녹음을 중지하고 oxygraph를 클릭하여 저장합니다. OK Control을 누른 다음 저장하고 연결을 끊습니다. 그런 다음 호흡 평가를 수행하기 위해 챔버를 열고 내부의 배지를 흡입합니다.
투과화된 세포 분석을 위해 2밀리리터의 MRM의 최종 부피에 정자 세포를 로드합니다. 하단 모서리에 있는 POS 보정 상자를 두 번 클릭하고 이전에 수행한 보정을 열어 보정을 로드합니다. 그런 다음 실험을 중지합니다.
4.5마이크로리터의 10밀리몰 디지토닌을 주입하고 5분 동안 세포를 투과시킵니다. 안정적인 신호가 얻어질 때까지 최소 5분 동안 온전한 세포의 호흡을 기록합니다. 그런 다음 복합 I 또는 복합 II에 대한 기판을 추가하고 신호가 증가하고 안정화 될 때까지 산소 소비량을 측정합니다.
다음으로, 5마이크로리터의 0.5몰 ADP를 주입하고 신호가 증가하고 안정화될 때까지 산소 소비량을 측정합니다. ATP 합성효소 억제제인 올리고마이신(Oligomycin)을 밀리리터당 1마이크로리터 4mg씩 추가합니다. 신호가 감소하고 안정화될 때까지 산소 소비량을 측정합니다.
최대 비결합 호흡수에 도달할 때까지 0.1mmolar에서 1mcalcal까지 연속적인 단계로 1마이크로리터의 FCCP를 첨가하여 적정합니다. 신호가 증가하고 안정화될 때까지 산소 소비량을 측정합니다. 산소 소비량이 감소하기 시작하면 약물 주입을 중단하십시오.
마지막으로, 복합체 I의 경우 1밀리몰 로테논 1마이크로리터 또는 복합체 II의 경우 5밀리몰의 항마이신 A를 주입하여 미토콘드리아와 잔류 산소 소비량을 구별합니다. 신호가 감소하고 안정화될 때까지 산소 소비량을 측정합니다. 데이터 분석을 수행하려면 기질 또는 억제제 주입 후 부피당 상관 관계가 있는 산소 플럭스가 안정적인 영역을 선택하고 마크를 클릭한 다음 통계 창을 클릭하고 데이터를 내보냅니다.
100만 개의 정자 세포당 얻은 데이터를 정규화하고 모든 값에서 비미토콘드리아 산소 소비량을 뺍니다. 이 방정식을 사용하여 지수를 계산합니다. 정액 샘플에서 온전한 정자 세포를 성공적으로 기록하는 데 성공했는데, 여기서 파란색 선은 산소 농도를 나타내고 빨간색 선은 상관 관계가 있는 부피당 산소 흐름을 나타냅니다.
정자 세포 수가 적을수록 기본 산소 소비량이 낮아졌습니다. 또한, 미토콘드리아 복합체 I 또는 복합체 II에 대한 산소 소비 곡선은 이 프로토콜을 사용하여 얻어졌다.
