이미지 획득을 위해 LightBox 소프트웨어를 엽니다. 레이저 및 필터 세트를 선택하려면 염료 목록에서 염색에 사용된 염료를 선택하여 주황색 염료에 대한 매개변수를 사용합니다. 개요를 사용하여 라이브를 클릭하여 셀에 초점을 맞춥니다.
세포에 초점이 맞춰지면 공초점 획득 설정을 조정합니다. 그런 다음 직사각형 ROI 버튼을 선택하고 클릭하고 드래그하여 영역 모양을 만들어 관심 미토콘드리아 주위에 관심 영역을 만듭니다. 유도 방출 고갈 또는 스테드 획득을 위해 검출기 게이팅을 조정하려면 일반 메뉴 옆에서 게이팅 메뉴를 선택하거나 길게 클릭하여 뷰에 메뉴를 추가합니다.
스테드 획득을 위해 여기 레이저를 15-20%로 설정하고 스테드 공핍 레이저를 20-25%로 설정하고 10개의 라인 축적을 설정합니다. 4마이크로초의 픽셀 체류 시간과 20-25나노미터의 픽셀 크기를 사용합니다. 시간 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 반복 횟수를 5로, 시간 간격을 25초 또는 30초로 설정하여 타임랩스를 수행합니다.
볼륨 옵션을 사용하여 Z 스택을 가져오고 원하는 Z 볼륨 범위와 단계 크기를 조정할 수 있습니다. 스테드 이미지 디콘볼루션 소프트웨어를 열어 소프트웨어 알고리즘으로 원시 스테드 이미지를 디콘볼루션합니다. 미세한 매개변수가 올바른지 확인한 후 익스프레스 버튼을 선택하고 다양한 정도의 디콘볼루션 전력에 대해 디콘볼루션 유형을 너무 빠르거나, 표준적이거나, 적극적이거나, 보수적으로 설정합니다.
디콘볼루션을 실행합니다. 이미지를 ICS2 형식으로 저장합니다. 이미지 J에서 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭하여 디콘볼루션 소프트웨어에서 ICS2 파일을 엽니다.
플러그인을 선택한 다음 세분화를 선택한 다음 훈련 가능한 Weka 세분화를 선택하여 훈련 가능한 Weka 세분화 플러그인에서 디콘볼루션된 스테드 이미지를 엽니다. 분할 설정에서 Gaussian blur, membrane projections 및 sobel filter 기능을 선택합니다. 한 클래스는 cristae로, 다른 클래스는 background로 레이블을 지정합니다.
다음으로, 두 클래스 중 하나에 할당할 구조체 위에 선을 그립니다. 그런 다음 크리스타 또는 배경에 대해 오른쪽에 있는 추가 버튼을 선택합니다. 그런 다음 왼쪽에 있는 학습 분류자 단추를 선택하여 플러그인에 제공된 정보를 기반으로 맵을 생성합니다.
분류자 저장(save classifier) 버튼을 클릭하여 향후 세그멘테이션을 위해 분류기 설정을 저장합니다. 크리스타 확률 맵을 사용하여 이미지 J의 이미지를 이진화하여 이진 마스크를 생성한 다음 분석으로 이동한 다음 입자를 분석합니다. 마지막으로 다점 선을 그리고 선 두께를 몇 픽셀 너비로 조정하고 미토콘드리아에 맞게 선을 스플라인합니다.
이 연구에서는 그림과 같이 타임 랩스 이미징을 사용하여 미분화 레티노산 분화 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아를 이미징했습니다. 디콘볼루션된 스테드 이미지는 주어진 영역에서의 크리스타 주기성과 크리스타 크기 및 형상 측정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
