당나귀 혈청과 함께 바로 사용할 수 있는 차단 용액 한 방울을 조직 샘플에 피펫팅하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 가장자리를 딱딱한 표면에 대고 두드려 슬라이드에서 과도한 차단 용액을 제거합니다.
항체 희석 완충액에 1차 항체를 희석하여 각 샘플에 대해 100마이크로리터의 최종 용액을 준비합니다. 각 1차 항체에 대해 하나의 튜브와 각 isocontrol 항체에 대해 하나의 튜브를 설정하여 항체를 설정합니다. 100 마이크로 리터의 isocontrol 항체를 하나의 샘플에 고르게 퍼뜨리고 100 마이크로 리터의 골수 페 록시다제 및 시트룰린 화 히스톤 H3 또는 골수 페 록시다제 및 호중구 엘라스타제 항체 희석을 다른 샘플에 뿌립니다.
슬라이드를 습식 챔버에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 다음 날, 슬라이드에서 여분의 1차 항체 용액을 두드려 큐벳에 쌓습니다. 슬라이드를 5분 동안 3회 헹구고 트윈이 있는 Tris 완충 식염수를 사용하여 나머지 1차 항체 용액을 제거합니다.
두 개의 뚜렷한 형광 2차 항체, 골수과산화효소를 위한 당나귀 항염소 및 시트룰린 히스톤 H3 염색을 위한 당나귀 항토끼를 준비합니다. 항체 희석 완충액에서 각 항체를 밀리리터당 7.5마이크로그램 농도로 희석합니다. 슬라이드를 습식 챔버에 넣고 100마이크로리터의 2차 항체 용액을 각 샘플에 분주합니다.
빛으로부터 보호되는 실온에서 30분 동안 배양합니다. 슬라이드를 두드려 과도한 2차 항체 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣습니다.
결합되지 않은 항체를 씻어내기 위해 PBS로 채워진 염색 용기에 슬라이드를 각각 5분 동안 3회 담그십시오. dappy 용액을 준비하고 탈 이온수로 밀리리터당 1 마이크로 그램의 농도로 희석하십시오. 슬라이드 랙을 얼룩진 용액이 들어 있는 염색 용기에 담그고 어두운 곳에서 실온에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 슬라이드 랙을 PBS가 있는 염색 용기에 5분 동안 담가 과도한 얼룩 용액을 씻어냅니다. 마지막으로 커버 슬립과 장착 매체를 사용하여 샘플을 장착합니다. 시트룰린 화 히스톤 H3 항체는 세포 외 히스톤에만 결합하고 세포 내 히스톤의 염색을 나타내지 않았습니다.
인간 또는 마우스 특이적 골수과산화효소 항체는 특이적 염색을 나타내지 않았다. 보편적인 인간 및 마우스 항체는 골수과산화효소에 대해 일관되게 우수한 염색을 보여주었습니다. 차단제를 사용하지 않았을 때, 일부 마우스 샘플은 더 많은 비특이적 및 부분적 양성 염색을 보여주었습니다.
블로킹을 당했을 때 5분의 블로킹 시간은 10분의 블로킹 시간에 비해 좋은 결과를 보였다. 전자레인지 및 수조의 더 높은 온도는 일관되게 중간 정도에서 양호한 항원 회수를 보여주었습니다. 섭씨 60도의 수조에서는 부분적으로만 양성이거나 얼룩이 없었습니다.
이중 염색의 경우, 섭씨 96도의 수조에서 배양된 샘플에 대해 보다 유리한 결과를 얻었습니다. 그러나 섭씨 96도에서 배양 시간인 40분을 초과하면 항체 염색이 덜 강렬해졌습니다.
