시작하기 위하여는, 준비한 효모 이하 미토콘드리아 소포를 가지고 가고 생성된 소포 및 남아 있는 본래 미토콘드리아를 20, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G를 분리한다. 온전한 미토콘드리아는 소포가 상층액에 머무르는 동안 펠릿을 형성합니다. 다음으로, 상층액을 새로운 울트라 원심분리 튜브로 옮깁니다.
캐뉼라가 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 튜브 바닥에 2.5몰 자당 용액 0.3밀리리터의 쿠션을 로드하고 섭씨 4도에서 100분 동안 118, 000G에서 원심분리기를 로드합니다. 원심분리 후 소포는 자당 쿠션 상단에 디스크로 나타납니다. 상층액의 약 90%를 폐기합니다.
농축된 소포를 수확하려면 피펫팅을 통해 2.5몰 자당을 포함하여 나머지 완충액에 재현탁시킵니다. 서스펜션을 얼음처럼 차가운 Dounce 균질화기로 옮기고 폴리테트라플루오로에틸렌 포터를 사용하여 최소 10스트로크로 현탁액을 균질화합니다. 다음으로, 각 층에 2.2 밀리리터의 자당 용액을 포함하는 11 밀리리터 스텝 그래디언트를 준비합니다.
이 공식을 사용하여 자당 농도를 계산하십시오. 가장 높은 자당 농도를 원심 분리 튜브에 추가하고 층이 완전히 얼어 붙을 때까지 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 굴절계를 사용하여 샘플의 자당 농도를 측정합니다.
굴절계를 사용할 수 없는 경우 자당 농도가 2몰이라고 가정합니다. 자당 농도를 0.6 몰로 조절하기 위해, pH 7.4에서 적절한 MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F 및 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가하십시오. 그래디언트의 교란을 피하기 위해 샘플을 자당 그래디언트에 조심스럽게 로드합니다.
소포를 200, 000G 및 섭씨 4도에서 12시간 동안 원심분리합니다. 가능하면 경사가 중단되지 않도록 느린 가속 및 감속을 설정합니다. 그런 다음 1밀리리터 피펫을 사용하여 700마이크로리터 분획으로 그라디언트를 위에서 아래로 수확합니다.
그 결과 17개의 분수가 생성되어 충분한 분해능을 제공합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 72 % 트리클로로 아세트산을 개별 분획에 첨가하고 용액이 균질해질 때까지 혼합하여 순차적으로 실행되는 두 가지 트리클로로 아세트산 침전을 수행합니다. 얼음에 30 분 동안 분획을 정양하고 20 분 동안 20, 000 G 및 4 섭씨 온도에 분리해서 침전된 단백질을 펠릿으로 가둔다.
상층액을 버리십시오. 500 % 트리클로로 아세트산 용액의 28 마이크로 리터를 추가합니다. 잘 섞고 원심분리 단계를 반복합니다.
마지막으로 SDS-PAGE 및 면역블로팅으로 분획을 분석합니다. 온화한 초음파 처리의 중요성이 여기에 제시되어 있습니다. 미토콘드리아 외막 마커 Tom40은 초기의 저밀도 분획에서 농축되었고 후기 분획에서는 거의 없었습니다.
미토콘드리아 내막 마커 Tim17은 고밀도 분획에 농축되었습니다. 대조적으로, 접촉 부위 단백질 Mic60은 중간 자당 농도의 위반을 축적했으며, 이는 다양한 막 소포의 성공적인 생성 및 후속 분리를 나타냅니다. 대조적으로, 더 가혹한 초음파 처리 조건에서는 미토콘드리아 외막 마커 Tom40이 구배의 낮은 부분에서 검출 될 수 있습니다.
또한 중간 밀도의 Tim17 위반이 상당량 있었습니다.
