In Planta Gene Expression and Measurement of Chlorophyll Fluorescence of Non-Photochemical Quenching Values in Bamboo Leaves

야생형 및 아그로박테리움에 감염된 대나무 잎에서 게놈 DNA를 추출하는 것으로 시작합니다. 다음 PCR 조건을 사용하여 야생형 및 Agrobacterium 감염 대나무 잎에서 표적 유전자의 표적 부위를 포함하는 게놈 DNA를 증폭합니다. PCR 후, 1 마이크로리터의 age-1, 1 마이크로그램의 PCR 산물 및 5 마이크로리터의 10X 완충액을 함유하는 반응 혼합물을 준비하여 엔도뉴클레아제 효소 분해를 수행한다.

그런 다음 최종 부피 50마이크로리터까지 물을 추가합니다. 분해 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 겔 전기영동을 사용하여 소화된 DNA 단편의 비율을 분석합니다.

야생형 및 아그로박테리움에 감염된 샘플에서 분해된 단편을 비교하여 유전자 편집 효율성을 평가합니다. 대나무 묘목을 높은 광도 조건에 노출시켜 흡수된 빛의 양과 잎 광보호 시스템의 활성화량을 증가시킵니다. 그런 다음 IMAGING-PAM 형광측정기를 켜고 대나무 잎의 생체 내 광계 II 엽록소 형광을 측정하기 위해 광선 강도를 설정합니다.

RUBY 유전자에 의해 생성된 적색 베타 레인 색상은 대나무 잎에서 성공적인 아그로박테리움 매개 유전자 발현을 나타냅니다. 4가지 아그로박테리움 균주 중 GV3101 균주가 감염된 대나무 잎에 가장 큰 베타 레인 축적을 일으켰습니다. CRISPR-Cas9 구조체 감염 및 고광 처리 후 잎 잎의 특정 영역은 더 낮은 비광화학적 담금질 값을 보였습니다.

또한, 효소 분해 및 염기서열분석 분석을 통해 편집된 영역에서 PeVDE 유전자의 성공적인 돌연변이가 확인되었습니다. sgRNA1 및 sgRNA2 모두에 의한 편집 후 PeVDE 단편의 Sanger 염기서열 분석 결과는 PeVDE 유전자에서 긴 단편의 결실을 보여주었습니다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염 30일 후, PeVDE 및 PeCCR5 모두에 대해 sgRNA로 형질주입된 잎 부위는 더 낮은 비광화학적 담금질 값을 나타냈습니다.