Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography

세포 냉동 단층촬영을 위한 전자 현미경 그리드 준비를 시작하려면 그리드의 탄소 쪽이 위를 향하도록 글로우 방전 장치에 천공된 탄소 지지 필름이 장착된 그리드를 배치합니다. 그런 다음 15초 동안 0.39밀리바 대기압에서 45밀리암페어로 그리드를 방전합니다. 완료되면 여과지를 깐 깨끗한 용기에 그리드를 넣습니다.

다음으로, 피브로넥틴, 인산염 완충 식염수 또는 PBS, 플레이트 및 핀셋과 함께 그리드를 생물 안전 작업대로 옮깁니다. 마이크로 피펫을 사용하여 넉넉한 크기의 소 피브로넥틴 점 두 개를 6웰 플레이트 뚜껑과 같은 멸균 표면에 주조합니다. 점이 전체 그리드를 감쌀 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오.

그런 다음 5 x 15 핀셋을 구하여 그리드의 양쪽을 피브로넥틴 부착 용액으로 처리합니다. 소 피브로넥틴으로 치료하면 그리드가 끈적끈적해집니다. 그리드의 비탄소 표면을 6개의 웰 플레이트에 있는 빈 웰 바닥에 부드럽게 터치하고 핀셋을 풀어 그리드를 새 표면에 부착합니다.

다음으로, 그리드를 피브로넥틴 부착 용액에서 30분 동안 배양합니다. 그리드가 마르는 것을 방지하려면 15분마다 마이크로 피펫을 사용하여 그리드 위에 접착 용액을 1-2방울 떨어뜨립니다. 배양 후 마이크로 피펫으로 과잉 부착 용액을 제거합니다.

마이크로 피펫을 두세 번 사용하여 그리드 위에 직접 PBS 방울을 추가하여 그리드를 세척합니다. 생물 안전 캐비닛에서 UV 광선 아래에서 그리드를 1시간 동안 살균합니다. 최대 살균을 위해 그리드를 가능한 한 UV에 가깝게 배치하십시오.

10분마다 그리드 위에 PBS 1-2방울을 마이크로 피펫팅하여 멸균 중에 그리드가 건조되는 것을 방지합니다.