Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

다른 약물이 들어 있는 MCF-7 세포 2mL를 6웰 플레이트의 웰에 추가하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포 배양을 37% 이산화탄소로 배양합니다. 섭씨 4도에서 3분 동안 560 x g의 원심분리로 세포를 수확합니다.

그런 다음 예냉 PBS로 세포를 두 번 세척하고 세척 사이에 3분 동안 560 x g에서 원심분리합니다. 세척된 세포에 50마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 샘플을 얼음 수조에 15분 동안 넣습니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 8, 550 x g에서 원심분리하고 상층액 단백질 샘플을 수집합니다.

단백질 샘플과 로딩 버퍼를 4:1 비율로 결합합니다. 다음으로, 금속 욕조에서 100 분 동안 섭씨 100도에서 혼합물을 변성시킵니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 식히십시오.

10%SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 단백질 샘플을 분리합니다. 단백질을 0.22마이크로미터 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 5% BSA로 멤브레인을 차단한 후 섭씨 4도에서 해당 1차 항체로 밤새 배양합니다.

다음날 섭씨 37도에서 2시간 동안 염소 항토끼 IgG 2차 항체로 막을 배양합니다. 그런 다음 ECL 화학발광 용액을 사용하여 멤브레인을 현상하고 비접촉식 정량적 웨스턴 블롯 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 웨스턴 블롯 처리는 세포사멸 촉진 인자인 CC-9, CC-7, CC-3, Bim, Bax의 단백질 발현을 촉진하는 반면, 항세포사멸 BCL-2의 단백질 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

Salidroside는 눈에 띄게 p-PI3K에 PI3K 및 AKT에 대한 p-AKT의 비율을 제한했습니다. 한편, mTOR, HIF-1 알파 및 Fox01의 단백질 발현도 현저하게 억제되었습니다.