Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

시작하려면 메스로 안락사된 쥐의 등쪽 정중선을 따라 후두부에서 천골 부위까지 절개합니다. 입체 수술용 현미경을 사용하여 요추까지 층을 조심스럽게 절개합니다. 마지막 늑골 아치를 식별합니다.

마지막 경추와 천골을 식별합니다. 그런 다음 척추를 분리하기 위해 절단하십시오. 한 쌍의 해부 겸자를 사용하여 척추의 등쪽 후궁 절제술을 수행하여 척수를 추출합니다.

말초 신경계를 구성하는 구멍을 통해 나오는 신경을 제거합니다. 이제 적출한 척수를 해부판에 놓습니다. vannas 가위로 2mm 크기의 조각으로 자릅니다.

그런 다음 조각을 2밀리리터의 평평한 바닥 마이크로튜브로 옮깁니다. 마이크로튜브에 HBSS-LD 작업 용액 1밀리리터를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다.

5분마다 혼합물을 세게 소용돌이치십시오. 다음으로, 각 분해물의 내용물을 40미크론 크기의 여과기에 통과시킵니다. 그런 다음 2% FBS가 함유된 HBSS 7밀리리터를 첨가하여 소화를 중화하고 남은 조직을 분쇄합니다.

서스펜션을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴 후 섭씨 4도에서 5분 동안 220g으로 원심분리합니다. 이제 1밀리리터 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 그런 다음 펠릿을 2밀리리터의 HBSS-FBS에 담아 새로운 15밀리리터 원뿔형 튜브에 재현탁시킵니다.

90 % 등장 밀도 구배 배지 2 밀리리터를 튜브에 넣고 혼합물을 섭씨 18도에서 25 분 동안 160g으로 원심 분리합니다. 마지막으로 이송 피펫을 사용하여 계면을 회수하여 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. PBS 10ml로 세포를 세척한 다음 추가 실험 전에 섭씨 5도에서 5분 동안 220g에서 세포를 원심분리합니다.

추출된 미세아교세포의 정제는 FACS 염색으로 확인된 바와 같이 최대 99%의 세포 수율을 산출했습니다. 비활성화 미세아교세포와 일치하는 평균 크기가 10마이크로미터인 이중 양성 세포가 관찰되었습니다.