스탠드에 자기 분리기를 부착하여 시작하십시오. 선택 컬럼을 자기 분리기에 연결하고 선택 컬럼 위에 70미크론 셀 스트레이너를 놓습니다. 선택 컬럼 아래에 50밀리리터 튜브를 놓아 흐름을 수집합니다.
생쥐 뇌세포가 80% 밀도에 도달하면 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 헹굽니다. 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 중지 버퍼를 추가합니다.
셀 현탁액을 300G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 항체 염색의 경우, 100 마이크로리터의 PBS에 7개의 세포에 10개를 재현탁시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 LYVE-1 항체 용액을 넣고 잘 섞습니다.
혼합물을 섭씨 4도의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 세포를 원심 분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 PBS 1mL를 추가하고 300G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 헹굽니다.
마이크로비드 라벨링의 경우 펠릿을 100마이크로리터의 PBS와 20마이크로리터의 마이크로비즈에 재현탁시킵니다. 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 부풀어 오르고 배양합니다. 그런 다음 현탁액을 원심 분리하고 PBS 1 밀리리터로 펠릿을 세척하십시오.
다시 말하지만, 펠릿을 원심분리하고 자기 음성 배제를 위해 PBS 4밀리리터에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 70미크론 스트레이너에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 선택 컬럼을 3밀리리터의 PBS로 헹구어 준비합니다.
그런 다음 선택 열에 셀 일시 중단을 추가합니다. 3밀리리터의 PBS로 컬럼을 세척하고 LYVE-1 음성 세포를 50밀리리터 튜브에 수집합니다. 자기 양성 선택의 경우, 6 밀리리터의 PBS를 선택 컬럼에 피펫팅합니다.
그런 다음 플런저를 선택 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기 표지된 세포를 플러시하여 LYVE-1 양성 LLEC를 얻습니다. 다음으로, 양극 세포 현탁액을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 평방 센티미터당 10개에서 5번째 세포를 5밀리리터의 배양 배지가 있는 T25 플라스크에 플레이트합니다.
격일로 배지의 50%를 교체하여 배양을 유지합니다. 세포가 80% 밀도에 도달하면 세포 통과를 수행하기 전에 이전에 설명한 대로 세포를 분리합니다. 유세포 분석 결과 2번 통로에서 LYVE-1 양성 세포의 비율이 MACS 후 3번 통로와 크게 다르지 않았으며, 이는 95% 이상의 순도를 나타냄 면역형광 염색 결과 LYVE-1과 PDPN, VEGFR-3 및 PROX1의 동시 염색이 확인되어 LLEC의 정체성이 확립되었습니다.
LYVE-1 양성 세포는 F48 및 혈소판 유래 성장 인자 베타를 발현하지 않아 LLEC를 대식세포 및 섬유아세포와 효과적으로 구별했습니다. MACS 이전의 연수막 세포는 둥근 구에서 융합된 섬유 모양에 이르기까지 이질적인 형태를 보였습니다. 그러나 MACS 이후 LLEC는 방추체 및 조약돌 모양과 같은 전형적인 내피와 유사한 특징을 나타냈습니다.
