클로렐라 심상성(chlorella vulgaris)의 통나무상 배양액 0.5m리터를 피펫팅하여 시작합니다. Tris-Acetate-Phosphate 또는 TAP Agar 플레이트에서 배양액을 퍼뜨립니다. 섭씨 25도에서 5일 동안 배양액을 배양합니다.
다음으로, 셰이커 플라스크에 전기 천공된 아그로박테리움 투메파시엔스 배양액으로 가득 찬 루프와 함께 보충된 LB 육수 10ml를 접종합니다. 플라스크를 섭씨 28도에서 30도, 250RPM에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양액 1밀리리터를 보충된 LB 50밀리리터에 접종합니다. 플라스크를 섭씨 28-30도, 250RPM에서 배양합니다.
조류 및 박테리아 배양을 공동 배양합니다. 먼저 아그로박테리아 배양액을 50밀리리터 튜브에 옮깁니다. 4, 실온에서 30분 동안 000G에서 튜브를 원심분리합니다.
그런 다음 상층액을 피펫팅하여 버리고 유도 매체를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 25ml의 유도 배지를 Chlorella Vulgaris 배양 플레이트에 추가합니다. 세포를 50 밀리리터 관으로 옮기고, 그 후에 4, 실내 온도에 15 분 동안 000 G에 분리기.
상층액을 폐기한 후 조류 세포 펠릿을 200마이크로리터의 박테리아 현탁액과 결합합니다. 배양액을 섭씨 21∼25도의 회전식 인큐베이터에서 150RPM으로 1시간 동안 흔든다. 혼합 배양액 200 마이크로리터를 유도 배지 플레이트에 펴고 15 밀리몰의 포도당을 보충하고 섭씨 21-25도의 어두운 곳에서 3 일 동안 플레이트를 배양합니다.
3일 후 10ml의 TAP 배지를 사용하여 미세조류를 플라스크에 수집합니다. 테트라사이클린 1리터당 20mg을 보충합니다. 플라스크를 어두운 곳에서 이틀 동안 배양하고 섭씨 21도에서 25도 사이의 온도를 유지합니다.
배양액 500 마이크로리터를 테트라사이클린 리터당 20mg이 보충된 선택적 배지에 도금합니다. 섭씨 21도에서 25도의 어둠 속에서 이틀 동안 접시를 배양한 후 조명이 켜진 방으로 옮깁니다. 변형 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 TAP 한천 플레이트에 줄무늬를 만듭니다.
콜로니 PCR을 수행하려면 먼저 소량의 형질전환 조류 세포를 10마이크로리터의 멸균수에 첨가합니다. 용액을 섭씨 98도에서 15분 동안 끓입니다. 마찬가지로 샘플에서 아그로박테리움 부재를 확인하기 위해 다른 PCR 템플릿을 처리합니다.
사다리가 있는 DNA 아가로스 겔에서 PCR 샘플을 실행하여 결과 단편의 크기를 확인합니다. 형질전환된 콜로니는 세포탁심(cefotaxime)과 함께 하이그로마이신(hygromycin)을 함유한 플레이트에서 성장할 수 있었다. 야생형 군체는 판에서 자라지 않았다.
세포탁심 리터당 최대 70mg의 내성을 가진 콜로니를 얻었다. pCAMBIA1302의 콜로니 PCR 앰플리콘은 조류 샘플에 없었다. 그러나 앰플리콘의 MGFP5G는 3개의 조류 샘플 모두에서 검출되었습니다.
반복적으로 세포탁심(Cefotaxime)의 하위배양이었던 조류 배양은 독성 단백질 E2의 결핍을 보여주었으며, 이는 플라스미드 결핍을 나타낸다. 형질전환체 및 야생형 균주의 조류 성장에 있어서의 유의한 차이가 관찰되었다. 더 낮은 성장에도 불구하고, 형질전환체는 세포 밀도에 대해 정규화될 때 더 높은 형광 수준을 가졌다.
