Purification of Human Solute Carriers (SLCs) for Developing SLC Targeting Therapies

냉동 용질 담체 또는 SLC 세포 펠릿을 실온의 수조에서 해동하는 것으로 시작합니다. 135mL의 염기 완충액과 3개의 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 결합하여 가용화 완충액을 준비합니다. 정제가 용해되면 펠릿을 가용화 완충액에 재현탁시킵니다.

그런 다음 deaminase를 추가하고 현탁액을 얼음 냉각 균질화기로 옮깁니다. 플런저를 약 20회 위아래로 움직여 용액을 균질화하고 균질기를 얼음 위에 유지합니다. 다음으로 세제 원액을 최종 농도 1%까지 첨가합니다.

가용화 혼합물을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 천천히 회전시킵니다. 1시간 후 혼합물을 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 4 내지 6 밀리리터의 베드 부피의 Strep-Tactin 수지를 베이스 완충액과 평형을 이룹니다.

그런 다음 가용화 된 상층액에 평형 수지를 첨가하고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 회전시킵니다. 용액을 중력 흐름 컬럼에 붓고 용액이 흐르도록 합니다. Strep Wash Buffer 베드 부피의 30배로 레진을 3단계로 동일한 단계로 세척합니다.

다음으로, 3-5 밀리리터의 환상 완충액을 첨가하고 용출액을 채취하기 전에 15분 동안 배양합니다. UV 흡수 분광법으로 단백질 농도를 측정합니다. 원하는 환상 분획을 결합하고 3C 프로테아제를 추가합니다.

튜브를 섭씨 4도에서 밤새 천천히 돌립니다. 다음날, 코발트 금속 친화성 수지의 베드 부피 2-4 밀리리터를 SEC 완충액과 평형화합니다. 평형 코발트 금속 친화성 수지를 하룻밤 동안 3C 반응 혼합물에 첨가하고 섭씨 4도에서 회전시킵니다.

1시간 후, 용액을 중력 흐름 컬럼에 붓고 흐름을 수집합니다. 섭씨 4도에서 3000g으로 회전하여 100킬로달톤 차단 원심 필터에 흐름을 농축합니다. SEC 버퍼가 있는 평형 덱스트란 아르고스 기반 SEC 컬럼.

샘플을 샘플 루프에 주입하고 컬럼 압력이 컬럼 제조업체의 사양보다 낮도록 유속으로 SEC 프로그램을 실행합니다. 분획 분취기를 사용하여 전체 SEC 실행에서 300마이크로리터 분획을 수집합니다. 피크 분획을 풀링한 후 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

그런 다음 샘플을 100킬로달톤 컷오프 필터에 필요한 부피로 농축합니다. 초기 소규모 SLC 단백질 발현은 SDS 페이지 전기영동으로 분석되었습니다. A GFP 태그된 SLC의 형광 현미경 검사는 상당한 세포 내 축적이 있는 원형질막에 특이적인 단백질 국소화를 확인했습니다.

화학적, 구조적으로 균질한 단백질은 크기 배제 크로마토그래피 동안 단일 단분산 A280 피크를 생성했습니다.