시작하려면 두 개의 새 팩스 튜브에 혼합 튜브 1과 2로 레이블을 지정합니다. 유세포 분석을 위해 주어진 표에 따라 세포 및 항체 현탁액을 준비합니다. 튜브를 30분 동안 배양한 후 각 튜브를 1mL의 염색 완충액으로 두 번 세척합니다.
와류 튜브를 실온에서 200G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 염색 완충액에 다시 현탁시킵니다. 48웰 플레이트의 웰에 200-500마이크로리터의 FBS를 바르고 1시간 동안 보관합니다.
그런 다음 잔류 FBS를 제거한 후 200 내지 500 마이크로 리터의 10 % MSC 배지를 피펫팅합니다. 단일 세포 분류를 위해 샘플을 준비하려면 1mL의 FBS를 두 개의 새 팩스 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 굴려 튜브의 내부 표면에 FBS를 균일하게 코팅합니다.
분류 실험을 위해 표와 같이 혼합 튜브 1과 2에서 세포와 항체 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 염색 완충액으로 세척한 후 실온에서 200G에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.
그런 다음 펠릿을 500 마이크로리터의 염색 완충액에 다시 현탁시키고 분류하기 전에 5 마이크로리터의 DAPI에서 15분 동안 배양합니다. 보정 매트릭스를 설정하려면 단일 얼룩 보정 튜브를 사용하십시오. 기기 소프트웨어의 도구 모음에서 실험을 클릭합니다.
그런 다음 보정 설정을 클릭한 다음 보정 컨트롤 만들기를 클릭합니다. 그런 다음 염색되지 않은 튜브를 클릭한 다음 세포분석기 대화 상자에서 파라미터를 클릭합니다. 각 매개변수의 값을 편집하여 전압을 조정합니다.
획득 대시보드에서 load(로드)를 클릭한 후 acquire(획득)를 클릭합니다. P-1 게이트를 셀 모집단으로 드래그하고 모든 보정 컨트롤에 적용하여 각 파라미터에 대한 전압과 음극 게이트를 설정합니다. 이제 단일 얼룩 보정 튜브를 개별적으로 로드합니다.
데이터를 기록하고 저장합니다. 현재 실험을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 보상 값 계산을 선택한 다음 링크 및 저장을 선택합니다. 혼합 튜브 하나를 실행하고 10, 000 세포를 기록하십시오.
적절한 게이팅 전략으로 정렬할 관심 모집단에 대한 게이트를 설정합니다. 다음으로, 수집 플레이트를 기기에 로드하고 웰당 2, 500에서 5, 000 셀 범위의 목표 셀 번호를 설정합니다. 그런 다음 단일 세포 분류 순도 마스크를 선택합니다.
수집 장치에서 분류된 세포 집단을 수집하여 분류 실험 기간 동안 얼음 위에 보관합니다. 마지막으로 플레이트를 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨 배양액을 섭씨 37도로 유지합니다. 다중 파라미터 유세포 분석 분석 플롯은 CD 90 FITC 항체의 FITC 동형이 발현되지 않는 것으로 나타났습니다.
마커 CD-90 및 CD-73의 양성 발현과 CD-45의 음성 발현은 염색되지 않은 대조군 및 FMO 대조군의 발현과 비슷합니다. 면역 표현형은 ISCT 권장 마커 및 CD-44를 사용한 초기 통로 중 하나의 마커 분포를 보여주었으며, 모집단을 MSC로 결정했습니다. 늦은 통로 헛간은 높고 희미한 표현기의 단일 세포 분류에 사용되었습니다.
48웰 플레이트에서 수집된 사후 분류된 세포는 부모 집단과 마찬가지로 부착 및 증식을 보여주었습니다. 포스트 분류된 세포는 adipogenic 성장 인자의 존재 하에서 분화되었다.
