먼저 UV 멸균 고처리량 플레이트와 트롬빈 분취액을 조직 배양 후드에 넣습니다. 준비된 세포 피브린 혼합물을 얼음 위에 올려 응고를 늦춥니다. P20 피펫을 사용하여 6마이크로리터의 세포 피브린 혼합물을 그립니다.
그런 다음 피펫 팁을 트롬빈 분취액에 부드럽게 넣고 기포가 생기지 않도록 두 번 혼합합니다. 고처리량 플레이트를 비스듬히 들어 올리고 피펫 팁을 로딩 포트 중 하나에 빠르게 삽입합니다. 피펫 플런저를 부드럽고 유동적인 동작으로 첫 번째 스톱까지 밀고 세포 피브린 혼합물을 조직 챔버에 주입합니다.
겔이 챔버를 완전히 통과하는지 확인합니다. 피펫 팁을 제거하거나 피펫을 옮기지 않고 플레이트를 평평하게 부드럽게 놓습니다. P20에서 손으로 피펫 팁을 제거하고 로딩 포트 구멍에 그대로 둡니다.
2분 후, 로딩 포트에서 부드럽게 비틀어 피펫 팁을 제거하고 플레이트 위에 뚜껑을 놓습니다. 겔 중합을 위해 섭씨 37도에서 15-20분 동안 플레이트를 배양합니다. 미세유체 장치를 현미경 스테이지에 놓아 기포 없이 챔버 전체에 세포가 고르게 분포하는 것을 관찰합니다.
P20 피펫 팁을 M1 또는 M3에 삽입하고 4마이크로리터의 라미닌을 천천히 배출하여 전체 상단 패널을 코팅합니다. 앞서 설명한 대로 피펫 팁을 제거하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 10분 동안 배양합니다. 275 마이크로리터의 EGM-2 전체 배지를 A열과 B열에 위치한 웰의 결합되지 않은 저장소에 추가합니다.P200 피펫 팁을 275마이크로리터의 EGM-2가 들어 있는 웰의 배지 입구 구멍에 삽입하고 75마이크로리터의 배지를 천천히 배출하여 매체가 채널을 통해 이동하고 반대쪽에서 거품이 생기는 것을 확인합니다.
피펫 팁을 제거한 후 팁에 남아 있는 미디어를 미디어 저장소로 밀어 넣습니다. 50 마이크로 리터의 배지를 추가하여 G 및 H행의 낮은 측면 웰을 완전히 덮고 설명된대로 플레이트를 1-2 시간 동안 배양합니다. 현미경으로 매체 채널의 기포를 식별하고 75마이크로리터의 매체를 채널에 다시 주입하여 기포를 제거합니다.
육안으로 중간 흡입구 또는 배출구에 기포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 P200 피펫 팁을 구멍에 삽입하고 플런저를 들어 올려 기포를 빼냅니다. 혈관화된 미세 장기 또는 VMO에서 내피 세포는 처음에는 조직 챔버 내에 고르게 분포되어 있지만 2일째에는 늘어나고 발광하기 시작했습니다.
넷째 날, 내피 세포는 외부 미세유체 채널과 문합되어 연속적인 혈관 네트워크를 형성했습니다. 미세한 혈관 네트워크를 통해 FITC-덱스트란을 관류하여 누출을 최소화함으로써 단단한 혈관 장벽 기능을 확인했습니다. MDA-MB-231 암세포를 VMO에 관류하면 내피 내막에 부착되어 세포외 공간으로 유출되어 관류 후 24시간 이내에 여러 개의 미세전이가 형성되었습니다.
타임 랩스 현미경 이미징을 통해 T 세포가 VMO의 세포 외 공간으로 유출되는 것이 45분 이상 관찰되었습니다. 혈관이 완전히 형성된 혈관화된 미세종양에서 T세포는 관류 시 혈관벽에 빠르게 부착되었습니다.
