Plating CFSE-Labelled Tumor Cells and Co-Culturing CAR-Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation

혈청학적 피펫 사용을 시작하려면 75% confluent MDA-MB-70 배양액이 들어 있는 T231 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 플라스크에 3 밀리리터의 트립신을 넣고 37도에서 5 % 이산화탄소로 3-5 분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 트립신을 중화하기 위해 플라스크에 3밀리리터의 DMEM을 추가합니다.

원심분리기 튜브에 셀 현탁액을 모으고 400G에서 4분 동안 회전합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 펠릿을 2밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다. 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.

10을 다섯 번째 셀에 8번 곱한 15밀리리터 튜브에 옮기고 PBS를 추가하여 부피를 1밀리리터로 만듭니다. 그런 다음 2 마이크로 리터의 CFSE를 튜브에 넣고 1 밀리리터 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 완전히 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 인큐베이터에 20분 동안 둡니다.

그런 다음 5mL의 DMEM을 튜브와 원심분리기에 추가하여 CFSE 라벨이 부착된 세포를 펠릿으로 떨어뜨립니다. 상층액을 버리고 펠릿을 DMEM 1밀리리터에 재현탁시킵니다. 세포 농도를 재평가한 후, 4회 10을 5번째 세포로 25밀리리터 시약 저장소로 옮깁니다.

DMEM을 첨가하여 부피를 8밀리리터로 만들고 세포 현탁액을 5밀리리터 혈청학적 피펫과 혼합합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 셀 현탁액을 검은색 96웰 플레이트의 왼쪽 절반에 있는 각 열로 옮깁니다. 마찬가지로 플레이트의 오른쪽 절반에 EGFR 녹아웃 셀 현탁액을 추가합니다.

균일한 셀 분포를 보장하려면 플레이트를 플랫폼에서 앞뒤로 좌우로 움직입니다. 종양 세포가 부착할 수 있도록 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다. 형질도입되지 않은 CAR 발현 Jurkat 세포의 수를 기반으로 4 곱하기 10을 5번째 CAR-J 세포를 25밀리리터 저장소로 전달합니다.

DMEM을 저장소에 최종 부피 2mL까지 추가합니다. 4:1의 이펙터 대 종양 비율의 경우, 부착된 종양 세포를 방해하지 않고 웰 측면을 따라 100마이크로리터의 배지에 웰당 네 번째 CAR-J 세포에 10을 두 번 추가합니다. 그런 다음 종양과 Jurkat 세포가 들어 있는 웰 측면에 100마이크로리터의 DMEM을 추가하여 웰당 300마이크로리터의 부피를 얻습니다.

종양 세포에 Jurkat 세포가 균일하게 분포되도록 설명된대로 플레이트를 움직입니다. 섭씨 37도에서 48시간 동안 이산화탄소 5%로 공동 배양합니다.