Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR-Jurkat Co-Culture with CFSE-Labeled Tumor Cells

CFSE 표지 종양 세포와 CAR 발현 jurkat을 공동 배양한 후 종이 타월로 플레이트를 부드럽게 뒤집고 두드려 CAR-J가 포함된 상층액을 버립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 부착된 종양 세포를 방해하지 않고 프로피듐 요오드(PI)가 함유된 100마이크로리터의 FluoroBrite DMEM 배지를 웰에 추가합니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 20 % Triton X를 각 종양 유형의 첫 번째 웰에 추가하여 완전한 데드 컨트롤 역할을합니다.

이미징하기 전에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 형광 이미징 후 세포의 종양 전용 웰 중 하나를 사용하여 녹색 형광 채널을 보정합니다. 웰 가장자리에 있는 세포를 제외하려면 웰 마스크를 98%로 줄이고, 녹색 형광 채널에서 CFSE 표지 종양 세포를 식별하고, 형광 강도 임계값을 조정하여 웰의 모든 세포를 캡처합니다.

CFSE 채널에서 감지된 파편을 제외하려면 최소 셀 직경을 25마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 개별 접촉 개체를 활성화하여 개별 셀을 식별합니다. 다음으로, 살아있는 세포 집단과 죽은 세포 집단을 정의하기 위해 게이트를 설정합니다.

CFSE 레이블이 지정된 셀을 선택하고 y축의 개수 히스토그램과 x축의 평균 PI 강도를 비교합니다. x축 값을 조정하여 세포를 더 잘 시각화하고 스플리터를 그려 PI가 낮은 염색된 세포와 PI가 높은 세포를 구별합니다. PI 염색이 낮은 세포를 살아있는 세포로 라벨링합니다.

다음으로, x축에 면적이 있고 y축에 count가 있는 라이브 셀에 또 다른 히스토그램을 설정합니다. 파편이 없는 세포를 큰 살아있는 세포로 라벨링합니다. 그런 다음 세포를 포획하고 파편을 걸러내기 위해 종양만 잘 사용하여 다른 스플리터를 그립니다.

전체 플레이트에서 해석을 실행한 후 숫자가 포함된 스프레드시트를 내보냅니다. CAR-J에 노출된 후 웰에 남아 있는 살아있는 CFSE 표지 종양 세포의 수를 결정하기 위해 큰 세포의 수를 플로팅합니다. 마지막으로 일원 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.

CAR-J1의 세포독성은 effector 대 종양 비율이 높을수록 증가하며, effector 대 종양 비율이 4:1일 때 50% 이상의 사멸이 관찰되었습니다. 변형된 힌지 도메인을 가진 EGFR 표적 CAR 작제물은 MDA-MB-231 세포를 발현하는 EGFR에 대한 항원 특이적 사멸을 나타냈으며, EGFR knockout 세포에 대해서는 유의한 사멸이 관찰되지 않았습니다. CAR 작제물은 또한 PBMC 유래 CD3 T 세포에서 발현되었다.

그러나, CD8 힌지 함유 EGFR-CAR의 발현은 없었다. IgG short는 IgG long 및 IgG 배지에 비해 MDA-MB-231 세포에 대한 세포독성 효능이 가장 낮았습니다.