시작하려면 PBS에 관류된 목이 잘린 쥐의 척수를 제거합니다. 얼음 위의 페트리 접시에 담긴 차가운 DPBS에 척수를 담그십시오. 18게이지 바늘과 차가운 DPBS로 채워진 10밀리리터 주사기를 사용하여 유압 압출을 사용하여 층류 후드에서 전체 척수를 격리합니다.
척수를 차가운 DPBS를 얼음 팩에 올려 페트리 접시에 옮깁니다. 층류 후드 내부의 현미경을 사용하여 날카로운 집게로 눈에 보이는 수막을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 척수를 빈 페트리 접시에 옮기고 No.10 수술용 메스 날을 사용하여 2-3mm 길이로 자릅니다.
척추 세포의 효소 해리를 위해 효소 믹스 1과 2를 척수 조각에 첨가하십시오. 척수가 균일하게 코팅되도록 접시의 효소를 여러 번 휘젓습니다. 접시를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 10분마다 접시를 수동으로 휘젓습니다.
배양 후 350 마이크로리터의 DNAse I.접시를 부드럽게 휘저어 섞습니다. 다음으로, 부드럽게 섞기 전에 0.5%FBS가 보충된 콜드 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 즉시 전체 내용물을 5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
P1000 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 세 번 삼중화합니다. 그런 다음 플러그가 꽂힌 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 5번 더 부드럽게 삼각 처리합니다. 튜브를 30초 동안 똑바로 세워 조직이 가라앉을 수 있도록 합니다.
P1000 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 30마이크로미터 필터를 통해 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 남은 조직이 있는 튜브에 FBS 보충 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 세 번 삼중합니다.
조직이 바닥에 가라앉도록 한 후 상층액을 30마이크로미터 필터에 통과시키고 이전에 사용한 것과 동일한 15밀리리터 튜브에 모읍니다. 여과된 셀 현탁액을 실온에서 300g에서 10분 동안 원심분리합니다. 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
성인 뇌 해리 키트에 제공된 파편 제거 용액을 사용하여 세포 펠릿에서 미엘린을 제거합니다. 그런 다음 펠릿에 FBS 보충 DMEM 5mL를 넣고 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집어 섞습니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 FBS 보충 DPBS 1밀리리터에 재현탁시킵니다.
상층액을 버리기 전에 다시 원심분리하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 Anti-ACSA-2 MicroBeads로 세포를 라벨링했습니다. 자기 분리 컬럼을 사용하여 양성 선택으로 세포를 분리합니다.
그런 다음 상층액을 버리기 전에 300g에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, 세포 펠릿을 1밀리리터의 따뜻한 FBS 보충 DMEM에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 혈구분석기로 옮겨 세포를 계수하고 생존율을 평가합니다.
75에 세포 농도를 조정하십시오, FBS DMEM를 가진 50 마이크로리터 당 000의 세포. 그런 다음 50마이크로리터의 셀 현탁액을 24웰 플레이트의 폴리-l-라이신 코팅 커버슬립으로 옮깁니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.
그런 다음 450 마이크로리터의 따뜻한 항생제 보충 FBS DMEM을 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 미세아교세포(microglia)와 성상교세포(astrocyte)의 성공적인 분리 및 증식이 관찰되었습니다. 넷째 날에는 성상교세포(astrocyte)가 더 긴 돌기를 형성하는 것이 관찰되었고, 더 짧은 방추체를 가진 타원형 소교세포(oval microglial cell)가 관찰되었습니다.
성상교세포는 7일째에 연결된 합류층(confluent layer)을 형성했고, 미세아교세포(microglia)는 점점 더 짧은 과정을 보였다. 세포 분류는 분리된 세포 배양의 92 내지 93%의 세포 생존율을 확인하였다.
