RNA 분석을 위한 George Washington University Genomics Core와 RNA 염기서열 분석을 위한 Q2 Lab Solutions의 Castle Raley에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)[보조금 번호 F31NS117085]와 로버트 H. 밀러 박사(Dr. Robert H. Miller)의 비비안 길 연구 기금(Vivian Gill Research Endowment)의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

모든 동물 관리 및 실험 절차는 조지 워싱턴 대학교 의과 대학 및 보건 과학 대학 (워싱턴 DC, 미국; IACUC#2021-004)를 참조하십시오. 이 연구는 생후 10주에서 5개월 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 야생형(WT) 마우스를 사용했으며, 이 마우스는 상업 공급업체( 재료 표 참조)에서 공급받아 조지 워싱턴 대학교에 보관되었습니다. 프로토콜 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 척수의 준비
<ol><li>아베르틴(멸균수에 2,2,2-트리브로모에탄올 12.5mg/mL 및 2-메틸-2-부탄올 12.5mg/mL)을 사용하여 동물을 마취시킵니다( 재료 표 참조). 마우스에서 발가락과 꼬리 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>말초 혈액 단핵 세포를 제거하기 위해 차가운 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 심장 관류를 수행합니다.<ol><li>동물을 얕은 쟁반에 놓고 흉막을 노출시키기 위해 측면을 절개합니다. 연동 펌프에 연결된 23G 관류 바늘( 재료 표 참조)을 좌심실에 삽입하고 펌프를 활성화합니다. 차가운 DPBS가 심장을 통과하면 우심방에 작은 절개를 만듭니다. 알림: 이 단계에서는 세포 생존력을 향상시키기 위해 더 빠른 관류 속도가 선호됩니다. 혈액은 1분 이내에 씻어내야 합니다. 간이 맑아지면 관류가 성공했음을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>큰 가위를 사용하여 동물의 목을 베고 척추14를 제거합니다. 조직 헹굼을 위해 얼음 위의 페트리 접시에 Ca2+/Mg2+/0.2% 포도당이 포함된 차가운 1x DPBS에 담그십시오.</li>
	<li>지금부터 모든 단계가 멸균 환경에서 수행되는지 확인하십시오. 유압 압출14 를 사용하여 전체 척수를 분리합니다. 18G 바늘과 10mL 주사기에 Ca2+/Mg2+/0.2% 포도당이 포함된 차가운 1x DPBS를 채웁니다. 척수를 전체 조직을 잠글 수 있도록 Ca2+/Mg2+/0.2% 포도당이 포함된 충분한 차가운 1x DPBS가 들어 있는 얼음 팩 위에 놓인 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>층류 후드 내의 현미경으로 수막을 조심스럽게 제거합니다. 척수를 얼음 팩에 담긴 빈 페트리 접시에 옮기고 10번 날 수술용 메스를 사용하여 전체 척수를 2-3mm 절편으로 자릅니다.</li>
</ol>2. 효소 세포 해리
<ol><li>제조업체의 프로토콜에 따라 시중에서 판매되는 Adult Brain Dissociation Kit에서 Enzyme mix 1 및 Enzyme mix 2를 추가합니다( 재료 표 참조). 척수가 균일하게 코팅되도록 접시에 효소를 여러 번 휘젓고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 5분마다 접시를 부드럽게 휘저어 조직 뭉침을 방지하고 시약이 고르게 분배되도록 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 꺼내고 최소 필수 배지(MEM)에 350μL의 0.46mg/mL DNAse I을 추가합니다( 재료 표 참조). 부드럽게 휘젓고 섞는다.</li>
	<li>차가운 DMEM/0.5% 소 태아 혈청(FBS) 1mL를 넣고 부드럽게 휘젓으며 섞습니다. 전체 내용물을 즉시 5mL 튜브에 옮깁니다.</li>
</ol>3. 기계적 세포 해리
<ol><li>P1000 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 세 번 삼중 처리하여 매번 조직 조각이 위로 올라와 조직을 더 해리하도록 합니다. 그런 다음 플러그가 꽂힌 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 공정 중에 기포가 생성되지 않도록 부드럽게 5회 더 삼각 처리합니다.</li>
	<li>5mL 튜브를 똑바로 세우고 조직이 바닥에 30초 동안 가라앉도록 합니다. 조직이 안정되면 P1000 피펫을 사용하여 상층액을 끌어올리고 30μm 필터를 통해 15mL 코니컬 튜브에 통과시킵니다.</li>
	<li>나머지 조직이 있는 동일한 5mL 튜브에 1mL의 콜드 DMEM/0.5% FBS를 추가합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 세 번 삼각 처리합니다.</li>
	<li>조직이 바닥에 30초 동안 가라앉도록 한 다음 상층액을 30μm 필터에 통과시키고 이전과 동일한 15mL 튜브에 수집합니다. 3.3단계와 3.4단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
	<li>여과된 셀 현탁액을 실온(RT)에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 진공 흡입기를 사용하여 생성된 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.</li>
</ol>4. 미엘린 제거
<ol><li>제조업체의 프로토콜에 따라 성인 뇌 해리 키트에 제공된 잔해물 제거 용액(DRS)을 사용하여 미엘린을 제거합니다. 이물질 제거 후 세포 펠릿에 5mL의 cold DMEM/0.5% FBS를 넣고 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 셀 현탁액을 실온(RT)에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다. 참고: 세포가 시험관 내 연구에 사용되고 배양 상태로 유지되는 경우 예열된 DMEM/0.5% FBS를 대신 사용해야 합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 DPBS/0.5% FBS에 재현탁시킵니다(RNA 연구의 경우 차갑게, 시험관 내 분석의 경우 따뜻하게). 세포를 계수하고 Trypan Blue를 사용하여 생존율을 평가합니다. 참고: 여러 동물의 세포 현탁액을 결합하여 세포 농도를 높일 수 있습니다.</li>
	<li>DPBS/0.5% FBS를 총 부피 5mL까지 추가하여 세포를 세척합니다. 현탁액을 실온에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.</li>
</ol>5. 미세아교세포와 성상교세포 분리
<ol><li>제조업체의 프로토콜에 따라 anti-CD11b 또는 anti-ACSA-2 마이크로비드로 세포를 라벨링합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 MS 컬럼을 사용하여 양성 선택으로 셀을 정렬합니다( 재료 표 참조). 분류 후 분류된 세포를 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
</ol>6. in vitro 분석을 위한 도금 세포
참고: 세포가 도금되지 않고 RNA 분석에 즉시 사용되는 경우 8단계로 진행합니다.
<ol><li>1mL의 따뜻한 DMEM/0.5% FBS에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 계수하고 혈구계를 사용하여 생존력을 평가합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>세포 농도를 50μL당 75,000개 세포로 조정합니다. 24웰 플레이트의 각 Poly-L-lysine 코팅 커버슬립11 에 세포 현탁액 50μL를 추가합니다.</li>
	<li>세포가 커버슬립에 부착되도록 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>450μL의 따뜻한 DMEM/5% FBS/페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep, 재료 표 참조)을 각 웰에 조심스럽게 추가합니다.</li>
	<li>3일 후 배지의 절반을 250μL의 따뜻한 DMEM/5% FBS/Pen-Strep으로 교체합니다. 유지 관리를 위해 미디어를 500-5일마다 따뜻한 DMEM/5% FBS/Pen-Strep으로 완전히 교체하십시오.</li>
</ol>7. 면역조직화학
알림: 배지를 한 번 이상 교체한 후 최소 3일 후에 면역조직화학 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 이렇게 하면 이물질이 제거되고 셀이 커버슬립에 완전히 부착됩니다.
<ol><li>배지를 제거하고 항 마우스 mAb O4(1:100)( 재료 표 참조)를 따뜻한 DMEM/5% FBS/10% 정상 염소 혈청(NGS)에 넣고 실온(RT) 또는 37°C에서 15분 동안 세포에 라벨을 붙입니다. 참고: 셀에 O7.3으로 레이블이 지정되지 않을 경우 이 단계를 건너뛰고 4단계로 진행하십시오.</li>
	<li>커버슬립을 따뜻한 DMEM/5% FBS에 세 번 담가 부드럽게 헹굽니다. 염소 항마우스 594 IgM(1:300)( 재료 표 참조)을 따뜻한 DMEM/5% FBS/10% NGS에 넣고 어두운 곳에서 15분 동안 실온에서 배양합니다. 따뜻한 DMEM/5% FBS로 3회 부드럽게 헹굽니다.</li>
	<li>4°C에서 15분 동안 차가운 5% 아세트산/메탄올로 셀을 고정합니다. 1x PBS로 3회 세척한 다음 적절한 항체로 라벨을 붙입니다: 1% Triton-X100/1x DPBS의 10% NGS에 항-토끼 GFAP(1:500), 항-마우스 GFAP(1:500) 또는 항-토끼 Iba1(1: 500 ). 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 알림: 커버슬립이 이미 O4로 얼룩진 경우 어두운 곳에 보관하십시오.</li>
	<li>PBS로 부드럽게 세 번 헹굽니다. 적절한 2차 항체가 포함된 라벨: 항-마우스 594 IgG (1:500), 항-토끼 488 IgG (1:500) ( 재료 표 참조). 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 부드럽게 세 번 헹굽니다. RT에서 1분 동안 DAPI(1: 1000)로 대조염색합니다. PBS로 세 번 헹구고 장착 매체를 추가하고( 재료 표 참조) 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.</li>
</ol>8. RNA 추출
참고: 이상적으로는 분석에 충분한 RNA를 추출하기 위해 최소 100,000개의 세포가 있어야 합니다. 필요한 경우 2-3개의 척수 세포를 결합할 수 있습니다.
<ol><li>제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조). 키트에 제공된 RW1 세척 버퍼를 사용한 각 세척 단계에 대해 셀을 세척 버퍼에 추가로 2분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 DNase I을 사용하여 남아 있는 게놈 DNA를 제거합니다( 재료 표 참조). DNase와 함께 상온에서 15분 동안 배양한 후 RW1 완충액으로 세척합니다.</li>
	<li>RNA 수율을 높이려면 용출 전에 RNAse가 없는 물에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 바이오분석기15 를 사용하여 RNA 무결성 및 양을 평가합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>

Efficient Extraction of Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord

<ol>
	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain.">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li><li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia.">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li><li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+neurons:+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic,+infectious,+inflammatory,+and+autoimmune+CNS+disorders.">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712 (2019).</li><li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia:+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer&#8217;s+disease.">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer&#8217;s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).</li><li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury.">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).</li><li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration,+and+its+regulation.">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li><li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS.">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li><li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation.">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).</li><li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord.">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).</li><li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes.">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li><li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes.">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175 (2022).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents.">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226 (2017).</li><li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA.">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li><li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation.">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).</li><li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li></ol>

없음

순수하고 생존 가능한 일차 세포의 분리는 특정 세포 유형의 구조와 기능을 조사하는 데 가장 중요합니다. 성체 마우스에서, 특히 척수에서, 이 작업은 현존하는 프로토콜이 종종 성체 척수에 맞추어지지 않기 때문에 상당한 도전을 제기한다(10,17). 이 프로토콜은 세포 배양, 유세포 분석, 조직학 및 전사체 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에...

성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 하는 다재다능한 신경교세포로, 신경 기능 조절, 중추신경계 발달에 기여, 혈액뇌장벽 유지, 기타 중요한 과정 참여 등의 역할을 포함합니다 1,2,3,4 . 항상성을 유지하는 역할 외에도 이 신경교세포는 부상 및 복구 메커니즘에서 중추적인 역할을 합니다. 미세아교세포(Microglia)는 모욕이나 부상 후 식세포, 염증 및 이동 능력으로 잘 알려져 있다 5,6,7. 질병에서 성상교세포의 반응은 염증, 신경교세포의 형성, 혈액뇌장벽의 손상에 대한 기여를 포함하여 똑같이 다양합니다 8,9. 중추신경계에서 미세아교세포와 성상교세포의 해로운 역할과 회복 역할에 대한 이해가 높아졌지만, 구조와 기능 모두에 내재된 이질성으로 인해 다양한 맥락에서 이를 연구하기 위한 강력한 도구가 필요합니다.
건강과 질병에서 미세아교세포와 성상교세포의 역할에 대한 더 깊은 통찰력을 얻으려면 in vivo 및 in vitro 조사의 결합된 접근 방식이 필요합니다. In vivo 기술은 중추신경계 내의 신경교세포와 뉴런 사이의 복잡한 누화를 활용하는 반면, in vitro 방법론은 특정 자극에 대한 단일 세포 기능 또는 반응을 평가할 때 가치가 있는 것으로 입증되었습니다. 각 방법은 고유한 이점을 제공합니다. In vitro 연구는 인접 세포의 직간접적인 입력 없이 이러한 세포 유형의 특정 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 또한 불멸 세포주를 활용한 in vitro 분석은 무한정 증식할 수 있는 능력, 비용 효율성 및 유지 관리 용이성을 포함한 특정 이점을 제공합니다. 그러나 일차 세포는 세포주에 비해 정상적인 생리적 반응을 더 가깝게 모방한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 생리학적 관련성은 기능적 분석 및 전사체 분석에서 매우 중요합니다.
특히 성체 쥐 척수에서 일차 세포를 얻는 데 있어 어려운 점 중 하나는 샘플의 양과 생존력에 있습니다. 성인 척수는 뇌보다 작고 상당한 양의 미엘린을 함유하고 있기 때문에 독특한 어려움을 겪고 있습니다. 신생아 동물 또는 성체 마우스 뇌10,11,12,13에서 순수하고 생존 가능한 신경교세포를 분리하는 것을 상세히 설명하는 몇 가지 발표된 프로토콜이 있지만, 이러한 방법론은 척수에 특이적인 질병 및 부상을 연구하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 효율적으로 분리하여 세포 배양 및 전사체 분석의 다운스트림 응용을 용이하게 하는 포괄적인 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 10주에서 5개월 사이의 성체 마우스에서 이러한 세포를 분리하는 데 성공적으로 사용되었으며, 조건부 녹아웃 마우스, 약물 반응, 발달 연구 및 연령 관련 모델과 관련된 연구를 포함하여 다양한 맥락에서 유용성을 입증했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>10861-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol, 98%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A18304-0F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45% glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL capped tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Adlrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>103-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA2 Microbead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type (WT) mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltrics 30 &#181;m filter</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber (Hemacytometer)</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4527-40KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>TMO</td>
			<td>15230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase for RNA purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A5209401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-33673</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody (rabbit)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 594 IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a11032</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 594 IgM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a21044</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit 488 IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a11008</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-1974</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C/L Pump System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Adlrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 9&#34; glass pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-079-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm</td>
			<td>Kawasumi</td>
			<td>D3K2-23G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pure astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord for in vitro assays and transcriptomic studies

성상교세포와 미세아교세포는 중추신경계 발달, 부상 반응 및 신경퇴행성 질환에 중추적인 역할을 합니다. 이러한 매우 역동적인 세포는 환경 변화에 빠르게 반응하며 형태학, 전사 프로파일 및 기능 측면에서 상당한 이질성을 나타냅니다. 건강과 질병에서 신경교세포의 기능에 대한 우리의 이해가 크게 발전했지만, 뚜렷한 세포 집단을 포괄적으로 특성화하기 위해 모욕 또는 부상의 맥락에서 수행된 체외 세포 특이적 분석의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 성체 마우스에서 세포를 분리하면 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 세포 분석이 가능하기 때문에 세포주 또는 신생아 동물에 비해 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 뇌 침범을 제외한 척수 특이적 분리에 초점을 맞추면 실험적 자가면역 뇌척수염, 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 척수 병리학에 대한 연구가 가능합니다. 이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 성상교세포와 미세아교세포를 분리하기 위한 효율적인 방법을 제시하여 기능적, 분자적 또는 단백질체 다운스트림 연구에서 잠재적인 응용 분야를 통해 즉각적인 또는 향후 분석을 용이하게 합니다.

Astrocytes and microglia are versatile glial cells that play vital roles in the central nervous system (CNS), encompassing responsibilities such as regulating neuronal function, contributing to CNS development, maintaining the blood-brain barrier, and participating in other critical processes1,2,3,4. Besides their role in maintaining homeostasis, these glial cells also play a pivotal part in injury and repair mechanisms. Microglia are well-known for their phagocytic, inflammatory, and migratory capabilities following insults or injuries5,6,7. Astrocyte responses in disease are equally diverse, encompassing contributions to inflammation, the formation of glial scars, and the compromise of the blood-brain barrier8,9. Although our understanding of the detrimental and reparative roles of microglia and astrocytes in the CNS has grown, the inherent heterogeneity in both their structure and function necessitates robust tools for studying them in various contexts.
Gaining further insight into the roles of microglia and astrocytes in health and disease requires a combined approach of in vivo and in vitro investigations. In vivo techniques leverage the intricate crosstalk between glial cells and neurons within the CNS, while in vitro methodologies prove valuable when assessing single-cell functions or responses under specific stimuli. Each method offers unique advantages; in vitro studies are essential for understanding the specific roles of these cell types without direct or indirect input from neighboring cells. Additionally, in vitro assays utilizing immortal cell lines present certain benefits, including the ability to proliferate indefinitely, cost-efficiency, and ease of maintenance. However, it&#39;s important to note that primary cells more closely mimic normal physiological responses compared to cell lines. This physiological relevance is crucial in functional assays and transcriptomic analyses.
One of the challenges in obtaining primary cells, particularly from the adult mouse spinal cord, lies in the quantity and viability of the samples. The adult spinal cord, being smaller than the brain and containing a significant amount of myelin, poses unique difficulties. While there are several published protocols detailing the isolation of pure, viable glial cells from neonatal animals or the adult mouse brain10,11,12,13, these methodologies may not be suitable for studying diseases and injuries specific to the spinal cord. In this protocol, we offer a comprehensive procedure to efficiently isolate pure, viable microglia and astrocytes from the adult mouse spinal cord, facilitating downstream applications in cell culture and transcriptomic analyses. This protocol has been successfully employed to isolate these cells from adult mice aged 10 weeks to 5 months, demonstrating its utility across various contexts, including studies involving conditional knockout mice, drug responses, developmental research, and age-related models.

저자 스포트라이트: Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord 

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

Our research aims to characterize specific cell populations in the central nervous system, specifically the spinal cord, using preclinical models of disease. And we are trying to determine how these cells are affected under pathological conditions and at different time points. It can be challenging to analyze cells, especially in the central nervous system because the cells in the brain and spinal cord form a highly complex matrix and everything is very tightly connected, so it can be difficult to isolate these cells without damaging the system.Our protocol addresses limitations in existing methods for studying spinal cord diseases by efficiently isolating viable microglia astrocytes from the small myelin-rich adult mouse spinal cord. This enables in vitro research on spinal cord related diseases in downstream analysis, filling a crucial research gap. This protocol presents several advantages such as analyzing astrocytes and microglia under pathological conditions and at specific time points.It also uniquely focuses on isolating glial cells from this adult spinal cord alone, excluding brain involvement. This allows researchers to study spinal cord pathologies at the cellular level.

이 프로토콜에 설명된 방법은 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 분리할 수 있도록 하여 체외 기능 또는 조직학적 분석 및 RNA 분석을 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야를 용이하게 합니다.
in vitro 연구를 위한 성공적인 분리는 며칠 동안 지속적인 세포 증식을 초래합니다. 성체 세포는 신생아 동물에서 분리한 세포에 ?...

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이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

우리의 연구는 질병의 전임상 모델을 사용하여 중추 신경계, 특히 척수의 특정 세포 집단을 특성화하는 것을 목표로 합니다. 그리고 우리는 이 세포들이 병리학적 조건과 다른 시점에서 어떻게 영향을 받는지 알아내려고 노력하고 있습니다. 뇌와 척수의 세포는 매우 복잡한 매트릭스를 형성하고 모든 것이 매우 긴밀하게 연결되어 있기 때문에 특히 중추 신경계에서 세포를 분석하는 것은 어려울 수 있으므로 시스템을 손상시키지 않고 이러한 세포를 분리하는 것이 어려울 수 있습니다.당사의 프로토콜은 척수 질환을 연구하는 기존 방법의 한계를 해결하여 미엘린이 풍부한 작은 성인 마우스 척수에서 생존 가능한 미세아교세포 성상세포를 효율적으로 분리합니다. 이를 통해 다운스트림 분석에서 척수 관련 질환에 대한 체외 연구가 가능하여 중요한 연구 격차를 해소할 수 있습니다. 이 프로토콜은 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 성상교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia) 분석과 같은 몇 가지 이점을 제공합니다.또한 뇌 침범을 제외하고 이 성인 척수에서만 신경교세포를 분리하는 데 중점을 둡니다. 이를 통해 연구자들은 세포 수준에서 척수 병리를 연구할 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

1.2K 조회수.  The George Washington University School of Medicine. 우리의 연구는 질병의 전임상 모델을 사용하여 중추 신경계, 특히 척수의 특정 세포 집단을 특성화하는 것을 목표로 합니다. 그리고 우리는 이 세포들이 병리학적 조건과 다른 시점에서 어떻게 영향을 받는지 알아내려고 노력하고 있습니다. 뇌와 척수의 세포는 매우 복잡한 매트릭스를 형성하고 모든 것이 매우 긴밀하게 연결되어 있기 때문에 특히 중추 신경계에서 세포를 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord 

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

연구

신경과학

Astrocyte and Microglial Cell Isolation from the Adult Mouse Spinal Cord

To begin, remove the spinal cord of a decapitated mouse that has been perfused with PBS. Submerge the spinal cord in cold DPBS in a Petri dish on ice. With an 18-gauge needle and a 10-milliliter syringe filled with cold DPBS, use hydraulic extrusion to isolate the entire spinal cord in a laminar flow hood.Transfer the spinal cord into Petri dish with cold DPBS placed on ice packs. Using a microscope inside the laminar flow hood, carefully remove any visible meninges with sharp forceps. Then, transfer the spinal cord to an empty Petri dish and use a No.10 surgical scalpel blade to cut it into two to three-millimeter-long sections.For enzymatic dissociation of the spinal cells, add Enzyme Mixes 1 and 2 to the spinal cord pieces. Swirl the enzymes in the dish several times to ensure uniform coating of the spinal cord. Incubate the dish at 37 degrees Celsius for 30 minutes, manually swirling the dish every 10 minutes.After incubation, add 350 microliters of DNAse I.Swirl the dish gently to mix. Next, add one milliliter of cold DMEM supplemented with 0.5%FBS before gently mixing. Immediately transfer the entire contents to a five-milliliter tube.With a P1000 pipette, gently triturate the tissue three times. Then, use a plugged nine-inch glass Pasteur pipette to gently triturate the tissue five more times. Place the tube upright for 30 seconds to allow the tissue to settle.With a P1000 pipette, aspirate out the supernatant and transfer it through a 30-micrometer filter into a 15-milliliter conical tube. To the tube with the remaining tissues, add one milliliter of FBS-supplemented DMEM. Then, gently triturate three times with a Pasteur pipette.After letting the tissue settle at the bottom, pass the supernatant through a 30-micrometer filter and collect it into the same 15-milliliter tube used earlier. Centrifuge the filtered cell suspension at 300 g for 10 minutes at room temperature. Use a vacuum aspirator to carefully discard the supernatant.Use the debris removal solution provided in the adult brain dissociation kit to remove the myelin from the cell pellet. Then, add five milliliters of FBS-supplemented DMEM to the pellet and gently invert the tube three times to mix. After centrifuging, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of FBS-supplemented DPBS.Centrifuge again before discarding the supernatant. Labeled the cells with Anti-ACSA-2 MicroBeads following the manufacturer's protocol. Use the magnetic separation columns to separate the cells by positive selection.Then, centrifuge the cells at 300 g for 10 minutes before discarding the supernatant. Next, resuspend the cell pellet in one milliliter of warm FBS-supplemented DMEM. Transfer the cell suspension to a hemocytometer to count the cells and assess their viability.Adjust the cell concentration to 75, 000 cells per 50 microliters with FBS DMEM. Then, transfer 50 microliters of the cell suspension to a poly-l-lysine-coated coverslip in a 24-well plate. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for two hours to allow the cells to adhere to the coverslip.Then, carefully add 450 microliters of warm and antibiotic-supplemented FBS DMEM to each well. Successful isolation and proliferation of microglia and astrocytes were observed. By day four, astrocytes were observed to form longer processes, while oval microglial cells with shorter spindles were seen.The astrocytes formed a connected confluent layer by day seven, with the microglia displaying fewer and shorter processes. Cell sorting confirmed 92 to 93%cell viability of the isolated cell culture.