먼저 세포 배양 삽입물을 24웰 조직 배양 어댑터 플레이트에 넣습니다. 인서트의 정점 쪽을 장내 성장 배지에서 100마이크로리터의 기저막 세포외 기질 또는 BME로 사전 코팅합니다. 장벽 무결성 측정 중 제어로 사용하기 위해 추가 인서트를 코팅합니다.
다음으로, 코팅된 인서트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 3D 장내형 배양 배지를 흡인합니다. 소의 회장 장내염을 얼음처럼 차가운 세척 배지 1m리터에 채취합니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 돔을 분리하고 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으십시오. 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 30회 트라이튜레이트하여 장내 절편을 생성합니다. 다음으로, 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 약 40회 더 트라이튜션하여 장내 조각을 분해합니다.
얼음처럼 차가운 세척 매체로 튜브의 부피를 10ml로 구성하십시오. 그런 다음 튜브를 300g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. BME 층을 포함한 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
다음으로, 4개의 돔마다 펠릿을 1밀리리터의 예열된 TrypLE 급성 효소에 재현탁시킵니다. 혼합물을 24웰 플레이트에 옮기고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 10분 동안 배양합니다. 1밀리리터 피펫으로 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 장내류를 더 분해합니다.
그런 다음 혼합물을 200마이크로리터 피펫으로 피펫팅하여 단편을 단일 세포로 분해합니다. 멸균 22게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 4회 흡입 및 분주하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 현미경을 사용하여 장내 생물의 80%가 단일 세포로 분해될 때까지 세포 해리를 모니터링합니다.
이제 셀 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으십시오. 반응을 소멸시키기 위해 4 부피의 FBS 세척 배지를 추가합니다. 그런 다음 미리 코팅된 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 장내형 물질을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 두 번 여과합니다.
현탁액을 300g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿으로 배출합니다. 상층액을 해리된 소 회장 장세포 현탁액의 원심분리기 튜브로 흡인합니다. 펠릿을 소량의 오가노이드 성장 배지에 재현탁시킵니다.
다음으로, Trypan Blue 염료 배제 분석법과 혈구계를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다. 세포 배양 삽입물에서 과도한 코팅 용액을 조심스럽게 제거합니다. 200 마이크로리터의 단일 셀 현탁액을 사전 코팅된 배양 삽입물의 정점 표면에 파종합니다.
이제 700마이크로리터의 FBS complete media를 인서트의 기저 측면에 추가합니다. 플레이트를 숫자 8 모양으로 약 10회 움직여 인서트 위에 셀을 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛의 플레이트 워머에 플레이트를 10분 동안 놓습니다.
37 시간에 5 % 이산화탄소 아래에서 섭씨 48도에서 접시를 배양합니다. 배양 후 정점 및 기저 성분의 배지를 신선한 장형 성장 배지로 교체합니다. 다음 날, 정점 및 기저 측면 구획에서 배지를 제거합니다.
PBS로 삽입물을 조심스럽게 세척하고 억제제만 보충한 장내 분화 배지로 교체합니다. 장권 형성은 도금된 소 토박물의 배양 후 몇 시간 후에 관찰되었다. 이틀 후, 구체의 내강이 잘 정의되었고, 넷째 날에 싹트는 구조가 관찰되었습니다.
성숙한 장류는 7일째에 관찰되었습니다. 7일 된 3D 장내염체의 면역염색은 서로 다른 세포 계통의 존재를 보여주었습니다. E-cadherin 단백질은 부착 접합부에 국한되었습니다.
장내분비 세포와 라이소자임 생성 파네스 세포에 대해 양성이었습니다. Confluent 2D 단층은 배양 1주일 이내에 관찰되었습니다.
