Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

시작하려면 안락사된 해부된 쥐의 뼈에서 조직을 제거합니다. 세척된 뼈를 얼음 위에 놓인 FACS 완충액이 들어 있는 새로운 6웰 플레이트에 넣습니다. 뼈를 2-5 밀리리터의 FACS 완충액이 있는 모르타르에 옮깁니다.

골수가 방출될 때까지 원을 그리며 뼈를 갈아줍니다. 3밀리리터 주사기로 골수를 위로 당겨 내려 균질화합니다. 균질액을 다른 주사기로 당긴 다음 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 여과합니다.

두 번째로 균질화하기 전에 FACS 완충액으로 필터의 조직 덩어리를 모르타르로 다시 헹굽니다. 이전과 같이 헹군 티슈를 걸러냅니다. 그런 다음 남은 뼈 스피큘을 FACS 완충액으로 모르타르에 다시 헹굽니다.

그런 다음 최대 수율을 보장하기 위해 조각을 15밀리리터 튜브로 씻어냅니다. 골수를 소화하려면 먼저 300G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 골수 펠릿을 2 밀리리터의 소화 혼합물에 재현탁시킵니다.

혼합물을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 회전근에서 45분 동안 배양합니다. 이제 효소 분해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다.

혼합물을 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 서스펜션을 섭씨 4도에서 7분 동안 400G로 원심분리합니다. 펠릿을 1mL의 RBC 용해 완충액에 재현탁시킵니다.

그런 다음 10mL의 FACS 버퍼를 추가하여 용해를 중단합니다. 그런 다음 이전과 같이 혼합물을 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 마지막으로 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 300G로 원심분리합니다.

상층액을 버린 후 펠릿을 100마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 뼈 스피큘의 소화를 위해서는 먼저 뼈 스피큘을 소용돌이치게 합니다. 상층액을 디캔팅하고 뼈를 바닥에 유지합니다.

다음으로, 뼈 미세 소화 혼합물 1m리터에 스피큘을 재현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 60분 동안 회전근에서 튜브를 배양합니다. 마지막으로 10mL의 FACS 완충액으로 분해를 중지합니다.

혼합물을 적혈구 용해 및 소화된 골수가 들어 있는 50밀리리터 튜브에 여과합니다.