Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

시작하려면 분리된 쥐 골수 현탁액과 뼈 스피큘 현탁액을 혼합합니다. 계수를 위해 세포 현탁액 10마이크로리터를 혈구계에 피펫팅합니다. 셀 현탁액을 섭씨 4도에서 300G에서 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 펠릿을 100마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 자기 공핍에 대한 항체로 세포를 염색하려면 FC 블록, CD45 APC 및 TER-119 APC를 추가합니다. 그런 다음 FACS 완충액으로 셀 현탁액을 세척합니다.

나머지 혼합물을 원심 분리 한 후 펠릿을 100 마이크로 리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 자기 고갈을 위해 세포 현탁액을 마이크로비드로 염색하려면 마우스 IgG 및 항 APC 마이크로비즈를 추가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

LD 컬럼을 2밀리리터의 MACS 버퍼로 세척합니다. 완충액에 세포를 재현탁시킨 다음 35마이크로미터 세포 스트레이너 캡이 있는 5밀리리터 시험관을 통해 여과합니다. 그런 다음 LD 컬럼을 자기 분리기 스탠드에 놓고 컬럼 아래에 5밀리리터 시험관을 놓아 용리된 물질을 수집합니다.

셀 현탁액을 LD 컬럼에 피펫팅하고 시험관에서 음의 분획 흐름을 수집합니다. MACS 완충액 1mL로 컬럼을 두 번 세척하고 동일한 튜브에 용리액 물질을 수집합니다. LD 컬럼을 새 5밀리리터 시험관 위에 놓습니다.

피펫을 사용하여 3mL의 완충액을 컬럼에 분주한 다음 양성으로 표지된 세포를 5mL 시험관으로 씻어냅니다. 양극 및 음극 분획을 모두 원심 분리 한 다음 펠릿을 100 마이크로 리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. CD45 TER-119 음성 분획을 염색하려면 6번째 세포에 10개마다 각 항체 1마이크로리터를 추가합니다.

서스펜션을 얼음 위에 20분 동안 놓습니다. 그런 다음 원심분리하기 전에 2mL의 FACS 완충액으로 현탁액을 세척합니다. 살아있는 세포 염색을 위해 펠릿 및 피펫 프로피듐 요오드화물에 완충액 1m리터를 추가합니다.

마지막으로, 35마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 샘플을 5밀리리터 시험관으로 여과한 후 다색 유세포 분석기에서 세포를 분석합니다. 세동맥 내피 세포는 급성 골수성 백혈병 미세환경에서 현저하게 확장되었으며 정현파 내피 집단에서 수반되는 손실이 발생했습니다. 중간엽 기질 세포의 작은 확장은 생후 8주에 관찰되었습니다.