DAKIKI 세포에서 C1GALT1 및 Cosmc의 mRNA 및 단백질 수준에 대한 DIO의 효과 검출

먼저 웰당 600만 개의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 DAKIKI 세포를 파종합니다. 다른 실험 그룹을 설정하고 해당 처리 후 그룹화 방법에 따라 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 24 시간 동안 플레이트를 배양합니다. total RNA 추출 키트의 지침에 따라 DAKIKI 세포에서 total RNA를 추출합니다.

각 샘플 그룹에서 추출된 RNA 1마이크로리터를 취하여 농도를 측정합니다. 키트 지침에 따라 각 샘플의 총 RNA 1마이크로그램을 상보적 DNA로 역전사합니다. 역전사 중합효소 연쇄 반응 또는 RT-PCR 증폭을 수행하여 각 유전자의 발현을 검출합니다.

초기 24시간 배양 후 웨스턴 블로팅의 경우 각 그룹에서 세포를 수집합니다. 수집된 세포에 적절한 양의 세포 용해 용액을 첨가한 후 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 13, 500g에서 샘플을 원심분리하고 추가 분석을 위해 상층액을 수집합니다.

단백질 시료를 5X SDS-PAGE Loading Buffer로 4:1의 비율로 소용돌이치게 하고 혼합된 시료를 섭씨 100도에서 5분 동안 가열하여 전기영동 전에 단백질을 변성시킵니다. 실행이 완료되면 겔을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 멤브레인을 차단하려면 실온에서 2시간 동안 5% 무지방 우유에 배양합니다.

그런 다음 베타-액틴 항체를 내부 대조군으로 사용하면서 해당 1차 항체로 멤브레인을 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 상응하는 2차 염소 항-토끼 IgG 항체로 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 단백질 밴드 검출을 위해 적절한 양의 향상된 화학밀루미늄 작업 용액으로 멤브레인을 처리합니다.

정량적 RT-PCR 결과는 C1GalT1 및 Cosmc의 상대적 mRNA 발현이 대조군에 비해 모델군의 DAKIKI 세포에서 하향 조절되었음을 보여주었습니다. Dioscin은 모델 그룹과 비교하여 두 가지 다른 정도의 상대적인 mRNA를 상향 조절했습니다. 웨스턴 블로팅 결과에서도 대조군에 비해 모델군의 DAKIKI 세포에서 C1GalT1 및 Cosmc의 단백질 발현이 감소한 것으로 나타났습니다.

단백질 발현은 dioscin 개입 후에 상향 조절되었습니다.