시작하려면 녹농균 배양균을 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 광학 밀도를 600나노미터로 설정하고 0.8% 식염수를 사용하여 적절하게 희석합니다. 멸균 와이어 루프를 사용하여 CAS 한천 플레이트에 박테리아 배양액을 줄무늬로 만듭니다.
CAS 한천 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양액을 96웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 배양액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
박테리아 배양액을 실온에서 4650g에서 10분 동안 원심분리합니다. 100 마이크로리터의 무세포 상층액을 피펫팅하여 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 CAS 염료를 우물에 첨가하십시오.
배양 전에 알루미늄 호일로 플레이트를 덮으십시오. 배양 후 630나노미터에서 분광광도계를 측정하고 사이드로포어의 총량을 사이드로포어 단위의 백분율로 계산합니다. 100 마이크로리터의 무세포 상층액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 피펫팅합니다.
그런 다음 100 마이크로 리터의 트리스 염산을 첨가하십시오. 405나노미터에서 용액의 분광 광도계 판독값을 측정합니다. 파이오쉐린 추출을 위해 먼저 녹농균의 48시간 배양액 100mL를 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다.
배양액을 4650g에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상층액에 1몰 구연산 5 밀리리터를 첨가하십시오. 용액에 에틸 아세테이트 50ml를 첨가하여 피오쉐린을 추출합니다.
주사기 필터를 통해 황산 마그네슘으로 유기상을 여과합니다. 그런 다음 유기상을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 마지막으로 320나노미터에서 분광광도계 판독값을 측정합니다.
3개의 임상 분리물과 기준 균주인 PAO1은 CAS 한천에서 성장했을 때 투명한 주황색 후광을 개발했으며, 이는 사이드로포어 생성을 나타냅니다. J3 분리물과 PAO1의 총 siderophore 생산 사이에 상당한 차이가 관찰되었습니다. pyoverdine 추출물의 분광 광도계 분석은 380 나노 미터에서 확인 피크를 나타 냈습니다.
모든 분리체가 피오버다인 생산에 양성인 반면, MR1 및 J3는 기준 균주에 비해 낮은 생산을 보였습니다. 파이오쉐린의 존재는 320나노미터의 피크로 확인되었습니다. 세 가지 임상 분리물 모두 PAO1에 비해 훨씬 더 많은 양을 생성했습니다.
