세포 통과 전. 6웰 플레이트에 콜드 코팅 용액을 코팅하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 1시간 동안 배양하고 인간 만능 줄기 세포가 들어 있는 6웰 플레이트에서 줄기 세포 배지를 흡인하고 각 웰에 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS 1밀리리터를 추가합니다. 두 번째 세척 후 500 마이크로 리터의 해리 용액을 각 웰에 넣고 실온에서 2-5 분 동안 배양합니다.
그 동안 6웰 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하고 각 웰에 1밀리리터의 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS를 추가합니다. 도립 현미경으로 세포 해리 과정을 관찰합니다. 세포의 80-90%가 둥글고 부착된 것처럼 보이면 6웰 플레이트의 웰에서 해리 용액을 흡인합니다.
그런 다음 10 마이크로몰 암석 억제제를 함유한 줄기 세포 배지 1mL를 6웰 플레이트에 추가합니다. 10 마이크로리터의 해리된 세포 현탁액을 튜브에 추가합니다. 그런 다음 같은 양의 트리판 블루를 추가합니다.
부드럽게 섞고 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포 계수 후, 0.8 내지 1 x 10을 밀리리터당 6번째 세포에 함유하는 웰당 2 밀리리터의 줄기 세포 배지와 10 마이크로몰 암석 억제제를 첨가한다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 세 번 움직입니다.
접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 10회 움직인 후 2시간 동안 배양합니다. 0일과 4일 동안 기초 배지를 모두 해동하고 보충제를 얼음 위에서 해동합니다.
매일 섭씨 37도의 수조에서 2ml, 중간 크기 1개, 중간 크기 1개를 5분 동안 데우십시오. 다음으로, 6웰 플레이트의 웰에서 줄기세포 배지를 흡인하고 세척 배지 1 2밀리리터를 추가합니다. 세척 매체 1을 흡인 한 후 즉시 1 일 매체 2 밀리리터를 우물 옆에 추가하십시오.
섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 분화 공정의 12일째에 400마이크로미터 마이크로웰이 들어 있는 6웰 플레이트를 2밀리리터의 접착 방지 헹굼 용액으로 처리합니다. 도립 현미경으로 플레이트에 기포가 있는지 관찰합니다.
기포가 관찰되지 않으면 접착 방지 헹굼 용액을 흡입하고 즉시 세척 배지 2 2 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 췌장 전구 배지를 흡인하고 웰당 0.5mL의 해리 완충액을 추가합니다. 세포를 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.
대부분의 세포가 둥글고 여전히 부착되어 있으면 해리 완충액을 흡입하고 즉시 각 웰에 1밀리리터의 따뜻한 클러스터 배지를 추가합니다. P1000 피펫 팁을 사용하여 원을 번갈아 가며 웰의 상단에서 하단으로 이동하면서 위아래로 피펫팅하면서 세포를 부드럽게 해리하여 웰 전체에서 세포를 고르게 분리합니다. 해리된 세포 혼합물을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
클러스터 배지 1밀리리터를 6웰 플레이트에 추가하여 나머지 세포를 모두 수집합니다. 다음으로, 마이크로웰 6웰 플레이트로부터 세척 배지 2를 흡인하고 해리된 셀 현탁액을 첨가한다. 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.
다음 날, P1000 피펫 팁을 사용하여 마이크로웰 6웰 플레이트에서 클러스터를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 천천히 수집합니다. 13일째 배지 1밀리리터를 첨가하여 나머지 클러스터를 수집하고 클러스터를 튜브로 옮깁니다. 세포가 중력에 의해 튜브 바닥에 자연적으로 5분 동안 고정되도록 합니다.
세포 클러스터를 방해하지 않고 튜브에서 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 13일째 배지 2mL를 튜브에 넣습니다. 클러스터의 흡인을 피하면서 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
서스펜션을 접착력이 매우 낮은 6웰 플레이트로 옮깁니다. 접시를 앞뒤로 좌우로 빠르게 6회 움직입니다. 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.
클러스터의 면역형광 이미지는 췌장 베타 세포 마커를 함께 발현하는 인슐린 생산 세포의 우세를 보여주었습니다. 베타세포 시그니처 유전자의 발현은 약 25%의 세포가 Nkx6.1을 발현하고 40%가 Pdx1을 발현하는 것으로 나타났다. 포도당 자극 인슐린 분비 분석 동안, MEL1 유래 클러스터는 낮은 포도당 농도에 비해 높은 포도당 농도에 반응하여 훨씬 더 높은 수준의 인슐린을 분비했습니다.
