시작하려면 DNase/RNase 유리수에서 RT-qPCR용 2X 완충액을 준비합니다. 더 사용할 때까지 버퍼를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 프라이머와 프로브를 1.5 밀리리터 튜브에 혼합합니다.
용리 버퍼로 부피를 구성합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 얼음 위의 1.5밀리리터 튜브에 Taq 중합효소 및 M-MLV RT가 포함된 효소 혼합물을 준비합니다.
Taq 중합효소 저장 완충액으로 부피를 구성합니다. 이제 100 마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액이 있는 별도의 튜브에 바이러스 합성 RNA를 다시 현탁시켜 마이크로리터당 10개에서 6번째 RNA 사본의 스톡을 만듭니다. 바이러스 스톡을 혼합하려면 SARS-CoV-2 인플루엔자 A와 B를 각각 5마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액 50마이크로리터에 추가합니다.
마찬가지로 SARS-CoV-2와 MERS-CoV를 혼합하여 두 번째 바이러스 혼합물을 얻습니다. 두 혼합물을 10배 희석하여 마이크로리터당 10개의 RNA 복제의 최종 희석을 얻습니다. 96웰 플레이트의 각 웰, 피펫 2X 완충액, 프라이머, 효소, DNase/RNase 자유수 및 해당 RNA 혼합물.
접착판 씰로 플레이트를 밀봉합니다. 그런 다음 플레이트를 1분 동안 원심분리하여 웰 바닥에 액체를 수집합니다. 다음으로, 실험 유형이 표준 곡선으로 설정된 고속 96웰 블록 유형을 수용하도록 PCR 기계를 프로그래밍합니다.
시약을 TaqMan 시약으로 설정하고 표준 실행 속성을 선택합니다. 유전자 표적과 리포터 염료를 정의합니다. 그런 다음 테스트할 각 반응에 대한 샘플 이름을 정의하고 플레이트 레이아웃에 표적과 샘플을 할당합니다.
이제 사이클 프로그램을 기기에 입력합니다. 플레이트를 올바른 방향으로 Real-Time qPCR 기계로 옮기고 실행을 눌러 사이클을 시작합니다. 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택합니다.
그런 다음 qPCR 프로그램에서 제공하는 증폭 플롯을 검사합니다. 개발된 두 키트는 반응당 최소 10개의 RNA 복제로 세 가지 표적 유전자를 동시에 성공적으로 증폭할 수 있었습니다. 모든 바이러스 적정에 대한 증폭 효율은 99% 이상이었습니다
