SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

이 분석의 전반적인 목표는 SARS-CoV-2, MERS, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B와 같이 일반적으로 순환하는 호흡기 바이러스를 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 접근법을 관리하는 것입니다. 우리 분야의 발전을 주도하는 지배적인 기술에는 CRISPR, 측면 유동 아미노 분석, 종이 기반 생체 분자 센서, 단일 냄비에서 Sherlock 테스트, DNA 압타머 및 루프 매개 등온 증폭과 통합된 다중 RT-qPCR이 포함됩니다. 램프. 그러나 멀티플렉스 RT-qPCR은 가장 민감하고 일반적이며 다양한 바이러스를 진단하기 위한 황금 표준입니다. 현재 실험적 과제는 10개 미만의 RNA 사본을 검출하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 확립하는 것입니다.

분석을 위해 자체 RT-qPCR 키트를 사용했는데, 이는 시간과 비용 효율적입니다. 시작하려면 DNA/RNA가 없는 물에서 RT-qPCR을 위한 2x 완충액을 준비합니다.완충액을 추가로 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 다음으로, 프라이머와 프로브를 1.5ml 튜브에 혼합합니다.

용리 완충액으로 부피를 보충한 다음 튜브를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 얼음 위에 1.5ml 튜브에 taq 중합효소와 MMLV-RT가 혼합된 효소 혼합물을 준비합니다. Taq 중합효소 보관 버퍼로 부피를 구성합니다.

이제 바이러스 합성 RNA를 100마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액이 있는 별도의 튜브에 재현탁하여 마이크로리터당 10-6번째 RNA 사본을 저장합니다. 바이러스 스톡을 혼합하려면 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 B를 각각 5마이크로리터씩 Tris-EDTA 완충액 50마이크로리터에 추가합니다. 마찬가지로 SARS-CoV-2와 MERS-CoV를 혼합하여 두 번째 바이러스 혼합물을 얻습니다.

두 혼합물을 모두 10배 희석하여 마이크로리터당 10개의 RNA 복제의 최종 희석을 얻습니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 2x 버퍼, 프라이머, 효소, DNA/RNA가 없는 물 및 해당 RNA 혼합물을 피펫으로 주입합니다. 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉합니다.

그런 다음 플레이트를 1분 동안 원심분리하여 웰 바닥에 액체를 수집합니다. 다음으로, 실험 유형이 표준 곡선으로 설정된 고속 96웰 블록 유형을 수용하도록 PCR 기계를 프로그래밍합니다. 시약을 TaqMan 시약으로 설정하고 표준 실행 속성을 선택합니다.

유전자 표적과 리포터 염료를 정의합니다. 그런 다음 테스트할 각 반응에 대한 샘플 이름을 정의하고 타겟 및 샘플을 플레이트 레이아웃에 할당합니다. 이제 사이클 프로그램을 기기에 입력합니다.

플레이트를 올바른 방향으로 실시간 QPCR 기계로 옮기고 run을 눌러 사이클을 시작합니다. 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택합니다. 그런 다음 QPCR 프로그램에서 제공하는 증폭 플롯을 검토합니다.

개발된 두 개의 키트는 반응당 10개의 RNA 사본으로 세 가지 표적 유전자를 모두 동시에 성공적으로 증폭할 수 있었습니다. 모든 바이러스 적정에 대한 증폭 효율은 99% 이상이었습니다.