형질전환된 Agrobacterium tumefaciens 의 스케일업 배양 및 대형 목본 식물의 아그로인 침투

먼저, 줄무늬는 Agrobacterium tumefaciens 세포 배양을 선택적 항생제 보충 효모 만니톨 한천 플레이트로 변환합니다. 스탠딩 인큐베이터에서 섭씨 28도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 배양액에서 콜로니를 12.5ml의 효모 만니톨 Luria-Bertani 육수 혼합물에 접종하고 섭씨 28도의 궤도 셰이커에서 250RPM으로 16시간 동안 배양합니다.

112.5ml의 효모 만니톨 국물에 12.5ml의 Agrobacterium 균주 LBA4404를 항생제와 함께 접종합니다. 섭씨 28도의 궤도 셰이커에서 250RPM으로 16시간 동안 배양액을 배양합니다. 배양액을 사용하여 야간 배양액을 광학 밀도 0.4로 조정합니다.

그런 다음 배양 전에 20 마이크로 몰의 아세토시린곤을 첨가하십시오. 배양된 배양액이 광학 밀도 1에 도달하면 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 현탁액에 펠릿을 0.6의 광학 밀도로 재현탁시키고 배양 전에 200마이크로몰 아세토시링곤을 첨가합니다.

아그로인스탈리즘의 경우, 잎이 있는 가지가 있는 목본 카카오 식물을 선택하십시오. 250 마이크로몰 자스몬산을 아그로박테리움 현탁액에 첨가합니다. 다음으로 진공 게이지가 있는 데시케이터를 진공 챔버로 설정하여 내부 압력을 측정합니다.

식물 가지가 통과할 수 있도록 점프 링을 놓습니다. 아그로박테리움 배양액이 담긴 비커를 데시케이터 안에 넣고 원하는 잎이 아그로박테리움 배양액에 잠기도록 데시케이터와 뚜껑 사이에 가지를 놓습니다. 다음으로 실리콘 인상재를 사용하여 점프 링, 식물 가지 및 데시케이터 사이의 틈을 밀봉합니다.

실리콘 재료가 중합되면 데시케이터를 닫고 틈을 남기지 않은 다음 진공 펌프에 연결합니다. 마이너스 0.07메가파스칼에 도달할 때까지 진공 펌프를 시작합니다. 원하는 압력에 도달하면 압력 밸브를 닫고 펌프를 꺼서 5분 동안 압력을 유지합니다.

압력 밸브를 점차적으로 꾸준히 열어 챔버 압력을 복원합니다. 침투를 두 번 더 반복한 후 세포 현탁액에서 가지를 떼어냅니다. 침투한 잎을 증류수로 세척한 다음 식물을 섭씨 25도의 어두운 곳에 48시간 동안 둡니다.

배양 후 침윤된 조직을 16시간의 밝은 사진 기간과 8시간의 어두운 사진 기간에 노출시킵니다. 식물의 침투 된 잎은 특정 부분에서 더 어둡게 나타나며 Agrobacterium 침투를 나타냅니다. 사용된 리포터 시스템은 잎에 베타린 축적을 생성했으며, 이는 육안으로 밝은 적색 색소 침착으로 쉽게 관찰할 수 있습니다.

베타린 축적은 조직 생존력에 따라 달라지는 것으로 관찰되었습니다.