동결건조된 MOG 35 55 펩타이드를 물에 다시 현탁시키는 것으로 시작합니다. 실험 전에 코팅 완충액에서 펩타이드 스톡을 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석합니다. 이제 최종 용액 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다.
코팅 완충액에 용해된 100마이크로리터의 BSA로 동일한 수의 웰을 동시에 코팅합니다. 증발을 방지하기 위해 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 0.5 % tween 20이 보충 된 200 마이크로 리터의 PBS로 플레이트를 3 회 세척하십시오.
그런 다음 PBS에서 100% BSA로 구성된 차단 용액의 웰당 3마이크로리터를 추가합니다. 밀봉된 플레이트를 혼성화 오븐에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척합니다.
EAE 면역 마우스의 혈액에서 얻은 각 혈청 샘플을 차단 용액에 희석하고 웰 당 100 마이크로 리터를 MOG 35, 55 및 BSA 코팅 웰 모두에 첨가하십시오. 지정된 빈 우물에 동일한 부피의 차단 용액을 추가합니다. 밀봉된 플레이트를 실온에서 지속적으로 흔들어 2시간 동안 배양합니다.
배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 헹굽니다. PBST에서 0.2%BSA로 구성된 용액에 HRP 접합 2차 항체를 희석하고 각 웰에 100마이크로리터를 첨가합니다. 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 일정한 흔들림을 유지하면서 배양합니다.
PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척합니다. 3, 3 프라임, 5, 5 프라임 테트라메틸 벤지딘 기질의 100 마이크로 리터를 각 웰에 추가하십시오. 어두운 곳에서 1-5분 동안 배양하여 파란색이 나타나는 것을 관찰합니다.
각 우물에 100마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다. 그런 다음 450나노미터 파장으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도를 측정합니다. EAE 샘플의 광학 밀도 값은 대조군 샘플보다 훨씬 높았으며, 이는 MOG 펩타이드에 대한 강력한 면역글로불린 G 반응을 나타냅니다.
