시작하려면 살아있는 세포 분석 시스템 소프트웨어를 시작하십시오. 화면 왼쪽 상단 모서리에 있는 더하기 기호를 눌러 선박 추가를 시작합니다. Scan on Schedule(예약 시 스캔)을 선택한 다음 New(새로 만들기)를 선택하여 스캔 프로그램을 실행합니다.
표준을 선택합니다. 그런 다음 스캔 설정을 셀별 옵션으로 None으로, 이미지 채널을 Phase, Green 및 Red로 설정하고 각각의 수집 시간을 설정합니다. 목표를 20x로 설정합니다.
목록에서 플레이트를 선택하고 플레이트를 이미징 시스템의 트레이에 놓을 용기 위치를 선택합니다. 샘플이 포함된 웰을 선택하고 웰당 캡처할 이미지 수를 결정합니다. 이 정보는 플레이트의 예상 스캔 시간을 자동으로 생성합니다.
플레이트 맵 생성(Create Plate Map)을 클릭하여 세포 유형 및 화합물과 같은 각 웰에 대한 정보를 입력합니다. 그런 다음 스터디의 이름을 지정합니다. 다음 화면에서 분석 유형으로 기본 분석기를 선택하고 이전에 사용한 분석 정의를 표시하는 드롭다운 목록에서 분석 정의를 선택합니다.
녹색과 빨간색 모두에 대해 스펙트럼을 혼합하지 않은 상태로 0.0으로 둡니다. 8시간 동안 15-20분마다 검사가 수행되도록 예약합니다. 화면 상단의 흰색 및 회색 막대를 드래그하여 스캔 시작 시간을 설정합니다.
다음 화면에서 스캔 설정을 검토하고 Add to Schedule(일정에 추가)을 눌러 스캔을 시작합니다. 스캔 후 보기 탭에서 분석을 위해 용기를 엽니다. 화면 왼쪽에서 Launch Analysis(분석 시작)를 누르고 Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성)을 선택합니다.
Basic Analyzer(기본 분석기)를 선택하고 Phase(위상), Green(녹색), Red(빨간색) 및 Overlap(겹침) 이미지 채널을 사용합니다. 훈련을 위해 6-8개의 대표적인 샘플 이미지를 선택합니다. 분석 정의를 구성하려면 녹색 물체를 호중구 세포외 트랩 또는 NET을 형성하는 호중구로 설정하고 빨간색 물체를 모든 호중구의 핵으로 설정합니다.
현재 미리보기 또는 모두 미리보기를 누르고 각 매개변수를 조정하여 결과를 최적화합니다. 분석을 위한 스캔 시간과 웰을 선택합니다. 그런 다음 분석 정의에 대한 레이블을 제공합니다.
요약을 검토하고 분석을 시작합니다. 해석 후 해석 정의의 이름을 두 번 클릭하여 해석된 스터디를 엽니다. 화면 왼쪽에서 레이어를 열고 각 셀이 올바르게 표시되었는지 확인합니다.
화면 왼쪽에서 그래프 메트릭을 클릭한 다음 녹색 개수에 대해 이미지당 개수를 선택합니다. 내보낼 시점과 웰을 선택합니다. 그룹화 선택의 경우 플레이트 맵 복제(Plate Map Replicates)를 선택하여 스캔하는 동안 모든 웰이 올바르게 지정되었는지 확인하고 데이터 내보내기(Export Data)를 클릭합니다.
마찬가지로, 빨간색 개수 및 겹침 개수에 대한 데이터를 내보냅니다. 주어진 방정식을 사용하여 각 조건 및 시점에 대해 셀을 형성하는 NET의 백분율을 계산합니다. NET 형성의 시간 경과는 각 시점에서 NET 형성 호중구의 백분율을 표시하여 시각화됩니다.
AKT 억제제를 추가하면 PMA 또는 칼슘 이온단으로 자극된 호중구에서 NET 형성을 차단했습니다. NET 형성을 표적으로 하는 잠재적 분자를 입증하는 것은 이 방법론을 사용하여 높은 처리량 방식으로 테스트할 수 있습니다.
