줄기세포 기반 치료를 위한 배양된 H9 배아 줄기 세포에서 3D 신경 망막 형성 유도

먼저, H9-배아 줄기세포를 Y-27632를 함유한 유지 배지에서 해동 및 배양합니다. 0일째에 콜로니가 70%가 되면 2밀리리터의 DPBS로 세척한 다음 리터당 20마이크로몰 Y-27632를 포함하는 0.5밀리리터의 세포 해리 용액으로 세포를 배양합니다. 분해를 중단하려면 리터당 20마이크로몰을 포함하는 3밀리리터의 유지 배지 Y-27632를 추가합니다.

세포를 펠트하려면 튜브를 190G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 성장 인자가 없는 화학적으로 정의된 배지 1밀리리터에 Y-27632로 재현탁시킵니다. 세포를 계수한 후 120만 개의 세포를 10mL의 성장 인자가 없는 화학적으로 정의된 배지에 넣고 잘 섞습니다.

그런 다음 100 마이크로리터의 셀 현탁액을 96웰 원뿔형 바닥판의 각 웰에 분배합니다. 가습된 5% 이산화탄소 분위기에서 배양합니다. 6일째에 망막 형성을 유도하려면 BMP4가 포함된 배지를 96웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 추가하고 다시 배양합니다.

9일, 12일, 15일째에 사용한 배지의 절반을 BMP4가 없는 새 배지로 교체합니다. 18일째에 형성된 배아체를 15밀리리터 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 배아체의 자연 침전 후 상층액을 부드럽게 제거하고 신경 망막 분화 배지로 헹굽니다.

그런 다음 배아체를 흡수율이 낮은 6웰 플레이트에 넣고 플레이트를 다시 배양합니다. 21일째 되는 날, 명시야 이미지는 이 방법을 사용하여 생성된 신경 망막의 연속적인 신경 상피 구조를 보여주었습니다. 망막 유도 성공률이 유의하게 높았으며, 이 프로토콜을 사용하여 생성된 망막 오가노이드는 다른 방법에 비해 크기와 형태가 유사했습니다.