G/I 테일링을 시작하려면 총 RNA, 테일 버퍼 믹스 및 테일 효소 믹스와 함께 얼음 위에 20마이크로리터 혼합물을 준비합니다. 섭씨 37도에서 열순환기에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 테일 스톱 용액을 넣고 2분 동안 얼음 위에 두십시오.
역전사 및 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 산물의 고분해능 겔 전기영동 후 소프트웨어를 사용하여 데이터에 액세스합니다. XAD 파일을 열고 트리 뷰 패널에서 샘플 이름 또는 래더를 선택합니다.
일렉트로페로그램과 젤 같은 이미지를 확대 및 축소하여 자세히 표시합니다. 피크 크기를 얻으려면 선택한 샘플의 전기 페로그램을 엽니다. electropherogram을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 수동 적분을 선택하면 수평선을 드래그하여 피크를 수동으로 선택할 수 있습니다.
피크 테이블에서 피크 값을 관찰하고 피크 높이가 가장 큰 피크를 식별합니다. 상단 메뉴에서 설정값 표시/숨기기 아이콘을 활성화합니다. 오른쪽에 새 패널이 나타납니다.
Advanced(고급)를 선택하고 Perform Smear Analysis(스미어 분석 수행)까지 아래로 스크롤한 다음 확인란을 선택합니다. 이렇게 하면 지역 테이블이 Electropherogram 탭에 추가됩니다. 그런 다음 일렉트로페로그램을 선택하고 지역 테이블로 이동합니다.
베이스 쌍에서 베이스 쌍으로(From Base Pair) 및 베이스 쌍으로(To Base Pair) 메뉴에서 일렉트로페로그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추가할 영역을 선택하여 시작 및 끝 베이스 쌍을 설정합니다. 지역 테이블의 아무 셀이나 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 지역 수정을 선택하여 사용자 지정 영역을 설정할 수 있는 작은 새 창 팝업을 만듭니다. 이 방정식을 사용하여 관심 있는 mRNA의 poly(A)tail length를 계산합니다.
그런 다음 Electropherogram 탭에서 Show Sizes 를 선택하여 Region 테이블을 베이스 페어에서 런타임으로 자동 변환합니다. CSV 파일을 열고 런타임에 대해 얻은 값을 선택하여 그래프를 생성합니다. 이 프로토콜을 사용하여 초파리 유충 뇌의 Dscam1 및 GAPDH 유전자의 poly(A)tail length를 분석한 반면 유전자 특이적 프라이머 쌍의 PCR 산물은 단일 밴드를 보여주었습니다.
유전자 특이적 범용 프라이머 쌍의 PCR 산물은 mRNA의 차등 poly(A) 길이를 나타내는 뚜렷한 도말 패턴을 보여주었습니다. 평균 폴리(A)꼬리 길이는 스미어 분석을 사용하여 구했습니다. 그리고 꼬리 길이의 범위는 전기 페로그램으로 표현되었습니다.
유사하게, S2 세포에 대한 poly(A)tail length 분석은 SV43 prime UTR 및 GAPDH 유전자에 대한 다중(A)꼬리 길이의 차이를 보여주었습니다.
