먼저, DMSO에서 밀리리터당 0.1밀리그램의 농도에서 양성 대조군으로 작용하는 합성된 펩타이드를 재현탁시킵니다. 재현탁 펩타이드를 비오틴화 히스톤 H4 펩타이드와 혼합하여 표준 곡선을 만듭니다. 다음으로, 아세틸화 반응을 96웰 PCR 플레이트에 중복하여 조립합니다.
20마이크로리터 반응은 효소 10마이크로리터, H4 펩타이드 1마이크로리터, 20X 완충액 1마이크로리터 및 DTT 1마이크로리터로 구성되어야 합니다. 각 웰에 1마이크로리터의 DMSO 또는 테스트 화합물을 추가합니다. 혼합물을 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
그런 다음 효소 억제제 착체를 허용하기 위해 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 아세틸화 반응의 지속을 위해, 2 마이크로 리터의 4-펜텐 오일 코엔자임 A를 4 마이크로 리터의 물과 결합하십시오. 이 혼합물 6 마이크로 리터를 우물에 첨가하십시오.
부드럽게 혼합한 후 혼합물을 실온에서 300G에서 30초 동안 원심분리합니다. 뚜껑이 있는 튜브에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 내용물을 배양합니다. 20마이크로리터의 8몰 요소로 내용물을 담금질하고 추가 처리가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.
다음으로, 80마이크로리터의 PBST를 BSA가 사전 차단된 검은색 NeutrAvidin으로 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 40 마이크로 리터의 반응 내용물을 플레이트의 웰에 첨가하십시오. 그런 다음 표준 곡선 펩타이드를 나머지 웰에 중복하여 피펫팅합니다.
결합을 용이하게 하기 위해 실온에서 1시간 동안 궤도 셰이커의 펩타이드를 부드럽게 저어줍니다. 결합이 완료되면 우물에서 액체를 흡입합니다. 접시 세척기를 사용하여 200마이크로리터의 PBST로 우물을 세척하십시오.
클릭 반응의 경우 THPTA 구리 혼합물을 물의 아스코르브산나트륨과 DMSO의 비오틴 아지드화물에 첨가합니다. 갓 혼합된 시약 19마이크로리터를 각 웰에 분배합니다. 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 이전과 같이 세척하기 전에 우물에서 용액을 흡입하십시오. 다음으로, 희석된 Streptavidin 양고추냉이 과산화효소 혼합물 100마이크로리터를 각 웰에 넣습니다.
실온에서 1시간 동안 궤도 쉐이커에서 부드럽게 교반하면서 배양합니다. Amplex Red 검출 시약을 결합하기 위해 희석된 과산화수소 500마이크로리터를 Amplex Red 시약에 피펫팅합니다. 이 혼합물 50 마이크로 리터를 인산 나트륨 4.5 밀리리터에 첨가하십시오.
Amplex Red 반응 혼합물 100 마이크로 리터를 세척 된 웰에 피펫팅합니다. 그런 다음 빛에서 떨어진 실온에서 30분 동안 접시를 배양합니다. SmartControl 소프트웨어를 실행하고 플레이트 아웃을 클릭합니다.
플레이트가 기기로 옮겨졌으면 Amplex 빨간색 아이콘을 클릭하고 플레이트 레이아웃을 변경합니다. Amplex 빨간색 아이콘을 다시 눌러 변경된 레이아웃을 확인합니다. 그런 다음 레이아웃에서 왼쪽 상단 표준 웰을 선택합니다.
파일 이름을 변경한 다음 조정 시작을 누릅니다. 게인이 설정되면 측정 시작을 클릭합니다. Current State를 눌러 실시간 측정을 관찰합니다.
측정이 끝나면 탭을 닫습니다. 그런 다음 상단 패널에서 마지막 실행 열기를 클릭합니다. 화성 탭으로 이동합니다.
그런 다음 홈 메뉴에서 Excel로 내보내기를 눌러 데이터 결과를 내보냅니다. 화합물 A와 C는 여러 희석을 위해 거의 100%까지 HAT1 활성을 억제하는 것으로 관찰되었습니다.
