시작하려면 쥐에서 분리한 대퇴골, 경골, 골반 및 상완골 뼈를 예로 들어 보겠습니다. 메스를 사용하여 긴 뼈의 성장판을 잘라 골단을 제거합니다. 얼음에 M199 배지와 2% FBS를 더한 10cm 접시에 넣습니다.
다음으로, 28게이지 바늘과 M199 배지와 2%FBS로 채워진 10밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 얼음 위의 15밀리리터 튜브로 세척합니다. 홍조된 뼈를 epiphysis와 함께 접시에 놓습니다. 골수가 가라앉을 때까지 15밀리리터 튜브를 얼음 위에 똑바로 세워 둡니다.
그런 다음 M199 배지와 2% FBS를 제거하고 B&M 해리 칵테일 4ml를 15밀리리터 튜브에 넣고 섭씨 37도의 수조에서 배양합니다. 배양 후 상층액을 수집하고 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 차가운 50밀리리터 튜브에 여과합니다. 남은 골수 펠릿에 신선한 B&M 해리 칵테일 2ml를 넣고 수조에 다시 넣습니다.
1밀리리터 피펫을 사용하여 남아 있는 골수 조각을 세게 피펫팅합니다. 이전과 동일한 튜브에 모든 세포 현탁액을 수집합니다. 20 밀리리터의 M199 배지와 0.5% BSA 및 2밀리몰 EDTA를 세포 현탁액에 추가합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 500G의 세포를 원심분리합니다. 0.5% BSA 및 비오틴 항체가 있는 500마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다. 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 궤도 쉐이커에서 배양합니다.
다음으로, 마그네틱 비드를 철저히 소용돌이칩니다. 25 마이크로리터의 비드를 튜브에 추가하고 오비탈 셰이커에서 다시 배양합니다. 튜브를 일치하는 자석에 2-3 분 동안 놓고 상층액을 새 튜브에 모읍니다.
50밀리리터 튜브의 납작한 캡 끝을 사용하여 10cm 접시에서 뼈를 더 작은 조각으로 부릅니다. 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 상층액을 여과하여 뼈 조각을 분리합니다. 세포 여과기의 뼈 조각을 가위로 자릅니다.
뼛조각이 있는 필터를 50밀리리터 튜브에 놓고 메스로 필터를 엽니다. 핀셋을 사용하여 뼈 분획을 5ml의 murine B&M 해리 혼합물로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 수평으로 넣고 120RPM으로 30분 동안 흔듭니다.
분해 후 0.5% BSA 및 2밀리몰 EDTA가 포함된 M199 배지 25밀리리터를 추가합니다. 기질 세포가 포함된 상층액을 70미크론 세포 여과기를 통해 차가운 50밀리리터 튜브에 여과합니다.
