살아있는 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)에서 당체의 상대적 pH를 측정하기 위한 유세포 분석 데이터 분석

시작하려면 불소 발현 Trypanosoma brucei 세포에 대한 유세포 분석을 수행합니다. 새 레이아웃을 열고 획득한 FCS 파일을 레이아웃 창으로 끌어다 놓습니다. 살아있는 세포를 게이팅하려면 염색되지 않은 야생형 컨트롤을 선택하여 창을 엽니다.

YL2H 또는 RL2H 채널에서 히스토그램을 사용하여 데이터를 분석합니다. 이 경우 샘플이 프로피듐 요오드화물로 염색되었으므로 YL2H 히스토그램을 사용하십시오. 다음으로, 살아있는 세포와 죽은 세포를 분리하기 위해 이등분선 게이트를 설정하여 왼쪽 게이트를 살아있는 것으로 표시하고 오른쪽 게이트를 죽은 것으로 표시합니다.

모든 샘플에 이 게이트를 적용하고 조정합니다. 데이터 세트의 여러 샘플에서 게이트를 확인하여 게이트가 제대로 그려졌는지 확인합니다. 염색되지 않은 야생형 컨트롤에서 라이브 게이트를 두 번 클릭합니다.

점도표의 X축을 전방 산점 영역으로, Y축을 측면 산란 영역으로 설정합니다. 그런 다음 Polygon gate 도구를 사용하여 셀 모집단의 윤곽을 잡고 cell이라는 레이블을 지정합니다. 파편이나 죽어가는 세포와 응집체는 점도표에서 일반적인 위치에 주의하여 제외합니다.

모든 샘플에 대해 라이브 게이트 아래에 셀 게이트를 적용하여 모든 샘플에 대해 가능한 세포 모집단을 포함하도록 합니다. 염색되지 않은 야생형 컨트롤에서 셀 게이트를 두 번 클릭하면 이 게이트 내의 이벤트를 볼 수 있습니다. 점도표를 조정하려면 X축을 전방 산점 영역으로 설정하고 Y축을 전방 산점 높이로 설정합니다.

이 점도표에서 단일 셀의 대각선 분포를 식별하여 doublet과 구별합니다. 다각형 게이트 도구를 사용하여 단일항 이벤트를 둘러싸고 이 게이트 단일항의 이름을 지정합니다. 모든 샘플에 대해 세포 게이트 아래에 singlets 게이트를 적용하여 singlet을 포함하면서 doublet을 제외하도록 하고 다른 샘플에서 필요에 따라 게이트를 조정합니다.

염색되지 않은 야생형 대조군 샘플에서 singlets gate를 두 번 클릭합니다. 점도표의 X축을 BL1H로, Y축을 VL2H로 변경합니다. 폴리곤 게이트 도구를 사용하여 대각선 게이트를 그려 VL2 및 BL1의 Fluorine-2 형광 셀을 캡처합니다.

이 게이트를 pHL 양성으로 레이블을 지정합니다. 모든 샘플에 대해 singlets gate 아래에 pHL positive gate를 적용합니다. 야생형 대조군의 자가형광 세포보다 형광 강도가 높은 세포를 덮도록 pHL 게이트를 조정합니다.

통계를 내보내려면 테이블 편집기를 클릭한 다음 편집 막대를 클릭하고 마지막으로 열 추가를 선택합니다. 총 미추출 카운트, pHL 양성 카운트, 총 라이브 빈도, 상위의 pHl 양성 빈도, pHL 양성 중앙값 VL2H 및 pHL 양성 중앙값 BL1H에 대한 컬럼을 통합합니다. 테이블 편집기에서 내보내기 설정을 조정하려면 표시를 파일로 설정하고 텍스트를 CSV로 설정합니다.

파일 대상과 이름을 선택한 다음 테이블 만들기를 클릭합니다. 굶주림에 대한 반응으로 시간이 지남에 따라 점진적인 온화한 산성화가 관찰되었으며, 이는 90분 동안 정체되었습니다. 녹색 선으로 표시된 대로 포도당을 재도입한 후 글리코솜 pH는 30분 만에 기아 이전 수준으로 돌아갔으며, 이는 글리코솜 pH가 포도당에 반응하여 동적이고 조절 가능하다는 것을 시사합니다.