1 안락사된 쥐에서 scBAT 2를 해부한 후, 3은 즉시 조직을 마이크로 원심분리 튜브에 넣었다. 4 멸균 바늘 5로 튜브 상단에 구멍을 뚫고 액체 질소에 스냅 얼립니다. 6 유봉과 얇은 주걱을 액체 질소에 담그십시오.
7 마이크로 원심분리기 튜브의 스냅 냉동 조직 샘플 8을 모르타르에 붓습니다. 9 모르타르 10에 소량의 액체 질소를 넣고 완전히 분쇄될 때까지 유봉 11로 조직을 철저히 갈아줍니다. 12 얇은 주걱을 사용하여 분쇄된 조직을 긁어내고 13 마이크로 원심분리기 튜브로 다시 옮깁니다.
14 모든 조직이 이송되면, 15 500 마이크로 리터의 RNA 분리 용액을 튜브 (16)에 첨가하고 펠릿 유봉 모터를 사용하여 30 초 동안 초음파 처리합니다. 17 다음으로, 주사기를 사용하여 10회 위아래로 피펫팅을 하고, 18 조직을 더 제거하고, 19 고체 입자가 보이지 않도록 합니다. 20 250 마이크로 리터의 클로로포름과 와류를 때때로 첨가하십시오 21 5 분 동안 실온에서 배양합니다.
22 21, 000 G에서 샘플을 원심 분리하여 섭씨 4도에서 20 분 23 ° 동안 추출합니다. 24 : 상부 수성층을 새 튜브 (25)로 옮기고 70 % 에탄올을 등가량으로 첨가한다. 26: 용해물(27) 500마이크로리터를 결합 컬럼으로 이송한다.
28 18, 000 G에서 60 초 동안 원심 분리하기 29 여과액을 버린다. 30 역전사의 경우, DEPC 처리수에 희석된 RNA 0.5 내지 1마이크로그램 31을 PCR 튜브 스트립에 첨가한다. 32 그런 다음 DEPC 처리수를 사용하여 CDNA를 마이크로리터당 250나노그램(33)으로 희석하고 정량적 PCR을 설정합니다.
34 scBAT 기능을 매개하는 데 관여하는 마커 유전자의 발현 수준(35)은 scBAT와 견갑간 BAT 간에 36 비교적 유사했다.
