먼저, 신경능선 유도(neural crest induction)를 받은 인간 만능줄기세포(human pluripotent stem cell)를 12일 동안 배양합니다. 세포에서 배지 C를 부드럽게 흡입합니다. 웰 표면적의 평방 센티미터당 100마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 세척한 다음 PBS를 제거합니다.
세포에 동일한 부피의 세포 분리 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 보충 하에 30분 동안 배양합니다. 플레이트에 동일한 부피의 NCC 매체를 추가합니다. 그런 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 채취하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
섭씨 20도에서 25도 사이에서 290G에서 2분 동안 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 펠릿에 12밀리리터의 NCC 배지를 피펫팅합니다.
서스펜션을 위아래로 기계적으로 피펫팅하여 서스펜션을 만듭니다. 그런 다음 셀 현탁액을 초저 부착 플레이트로 옮깁니다. 14일째에는 세포 배양 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 각 웰 중앙에 작은 스페로이드를 모읍니다.
P1000 마이크로 피펫을 사용하여 각 웰의 둘레에서 사용된 매체를 천천히 흡입합니다. NCC 배지의 원래 부피로 세포를 다시 공급합니다. 15일째 되는 날에 배지를 조심스럽게 제거합니다.
스페로이드를 세척하기 위해 웰에 PBS를 추가합니다. 그런 다음 가능한 한 많은 PBS를 제거하여 스페로이드가 방해받지 않도록 합니다. 다음으로, 웰 표면적의 평방 센티미터당 100마이크로리터의 세포 분리 용액을 추가합니다.
섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 아래에서 30분 동안 용액에 세포를 배양합니다. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰에 동일한 부피의 ENC 배지를 추가합니다. 용액을 기계적으로 피펫팅하여 남아 있는 스페로이드를 분해합니다.
그런 다음 세포를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 이전과 같이 원심분리 후 상층액을 폐기하십시오. 그런 다음, 5 내지 10 밀리리터의 ENC 배지에 세포를 재현탁시킨다.
trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 계산합니다. 지금, 대략 300, 000에서 400, 표면의 평방 센티미터 당 000의 실행 가능한 세포, 및 밀리리터 당 대략 1백만개의 세포의 조밀도를 도금하기 위하여 ENC 매체의 충분한 양을 추가하십시오. 그런 다음 우물에서 용액을 흡인합니다.
다음으로, PO/FN 라미닌 코팅 웰이 있는 플레이트에 셀을 추가합니다. 30일에서 40일까지 웰 표면적의 평방 센티미터당 200마이크로리터의 ENC 매체로 이틀에 한 번씩 셀을 공급합니다. 매끄러운 표면을 가진 고품질의 자유 부유 구체는 신경능선 유도 후 관찰되었습니다.
스페로이드는 신경능선 마커 SOX10을 발현했습니다. 신경돌기는 장 뉴런 유도 동안 25일에서 30일 사이에 관찰되었습니다.
