시작하려면 HEK 293 세포를 배양하는 데 필요한 모든 재료를 깨끗한 생물 안전 후드에 넣습니다. 해동 후 HEK 293 셀 현탁액을 바이알에서 50밀리리터 튜브의 30밀리리터 예열된 부유 셀 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 습도 80%, 이산화탄소 8%, 200RPM에서 3-4일 동안 세포를 배양합니다.
100 마이크로 리터의 셀 현탁액을 400 마이크로 리터의 0.4 % 트리판 블루 용액에 넣고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 50 마이크로리터의 Trypan Blue 처리된 세포 현탁액을 혈구계 슬라이드 카운트 총 생존 세포에 놓고 transfection에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산합니다. 예열된 부유 세포 배지에 필요한 양의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도에서 8%의 이산화탄소로 배양합니다.
300밀리리터의 부유 세포 배지에 밀리리터당 100만 개의 HEK 293 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도에서 8% 이산화탄소로 배양합니다. 2일째에는 부유세포 배지, 플라스미드 및 transfection 시약을 실온으로 예열합니다. 준비된 배지에 플라스미드를 넣고 간단히 와류한 후 transfection 시약과 vortex를 다시 잠깐 첨가한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다.
transfection 혼합물을 배양하는 동안 첫날에 배양한 세포를 계수하고 필요한 경우 세포 밀도를 밀리리터당 2개에서 250만 개 사이로 조정합니다. 30분 후, 튜브를 부드럽게 휘젓면서 transfection 혼합물을 세포에 적가하고 72-96시간 동안 배양합니다. 5일째 되는 날, 33mL의 10x 세포 용해 완충액을 세포에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.
현탁액을 섭씨 37도에서 1.5시간 동안 흔들면서 배양합니다. 세포 현탁액을 3, 428 G에 4°C에 60 분 동안 분리하십시오. 0.45미크론 PES 진공 필터를 통해 상층액을 여과하고 필터 용기에 정화된 용해물을 수집합니다.
40%PEG 8의 걸러진 세포 용해물의 360 밀리리터에 000 해결책의 90 밀리리터를 추가하십시오. 70% 에탄올 멸균 교반봉을 세포 용해물에 넣고 얼음이나 냉장실에서 300RPM으로 1시간 동안 저어준 다음 젓지 않고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
