먼저 전체 PEG 침전된 아데노 관련 바이러스 HEK293 배양액을 큰 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4 섭씨 온도에 15 분 동안 2, 820 g에 문화양을 분리하십시오. 상층액을 버리고 칼슘과 마그네슘이 함유된 15밀리리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시킵니다.
재현탁 부품을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 10밀리리터의 PBS를 추가하여 나머지 PEG 침전물을 수집하고 모두 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 40 마이크로 리터의 DNase I을 첨가하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다.
유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 25mm x 89mm 폴리알로머 튜브에 15.5ml의 농축 세포 용해물을 채웁니다. 새로운 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 용해물 아래에 9ml의 15% 요오딕산올 용액을 부드럽게 주입합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 25 % 및 40 % 요오드화 산올 용액을 첨가하십시오.
마지막으로 60% 요오딕산올 용액 5밀리리터를 추가합니다. 주사기를 사용하여 PBS로 튜브를 채우고 요오드화 층을 방해하지 않고 대부분의 기포가 제거되도록 합니다. 전기 튜브 토퍼를 사용하여 튜브를 밀봉합니다.
요오딕산올 구배의 다른 층이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 섭씨 16도에서 1시간 10분 동안 490, 000g에서 비 스윙 로터를 사용하여 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브를 금속 걸쇠에 조립합니다.
19게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 그런 다음 바늘을 삽입한 상태로 두고 30게이지 바늘을 사용하여 튜브 상단에 구멍을 뚫습니다. 페놀 빨간색 표시기로 표시된 대로 40%60%iodixanol 인터페이스 바로 아래에 튜브를 조심스럽게 뚫습니다.
바늘 경사가 40% 층을 향하도록 하십시오. 바이러스-요오드산올 혼합물을 천천히 추출하면서 자주 사용하지 않는 손으로 30게이지 바늘을 제거합니다. 반쯤 베벨이 아래를 향하도록 바늘을 돌리고 단백질층에서 수집되지 않도록 추출을 계속합니다.
추출 후 즉시 초원심분리기 튜브를 50밀리리터 튜브로 옮겨 폐기합니다. 수집된 AAV-요오드릭사놀 현탁액을 15밀리리터 튜브에 넣고 PBS에서 5배로 희석하여 최대 15밀리리터를 채웁니다. 현탁액을 원심 필터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 3, 428g에서 10분 동안 원심분리기를 사용합니다.
플로우 스루를 버린 후 15 밀리리터의 PBS 5 % 자당을 여과액에 첨가하고 재현탁시킵니다. 원심 필터 튜브에서 농축된 AAV를 수집합니다. 마지막으로, 바이러스 분취액을 섭씨 4도에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
