시작하려면 굶주린 L1 단계 Caenorhabditis elegans 유충이 차지하는 선충 성장 배지 또는 NGM 플레이트를 선택하십시오. 멸균수 1ml를 사용하여 접시에서 벌레를 부드럽게 씻어냅니다. 웜 개체군의 약 300마이크로리터를 농축된 OP50으로 파종된 NGM 플레이트에 분주합니다.
플레이트 건조기 또는 Bunsen 버너를 사용하여 플레이트를 건조시킨 다음 상당한 개체군이 중력이 있는 성인이 될 때까지 섭씨 20도에서 배양합니다. 벌레를 수집하려면 최대 10ml의 멸균수로 접시에서 씻어내고 따뜻한 물 혼합물을 15mil 원추형 튜브에 옮깁니다. 웜이 중력에 의해 튜브 바닥에 약 4분 동안 가라앉도록 합니다.
작은 피펫 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입하고 버립니다. 그런 다음 최대 15mL의 멸균수를 추가합니다. 최종 세척 후 상층액을 제거하고 갓 준비한 표백제와 수산화나트륨 용액 5ml를 추가합니다.
실온에서 5분 동안 웜을 배양하고 최소 10초 동안 매분 소용돌이칩니다. 해부 현미경을 사용하여 진행 상황을 모니터링합니다. 모든 성체가 분리되어 열리거나 용해되면 M9 완충액을 첨가하여 반응을 중화시켜 최종 부피를 15ml로 만듭니다.
그런 다음 1, 300 G.Wash를 통해 13 밀리리터의 M9 완충액으로 계란을 두 번 더 세척 한 다음 15 밀리리터의 S 완전 완충액으로 한 번 세척합니다. 그런 다음 원심분리 후 1, 300 G.After에서 2분 동안 계란을 원심분리하고 상층액을 흡인하고 S 완전 완충액 10밀리리터를 추가합니다. 돌연변이원 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 실온에서 밤새 튜브를 부드럽게 회전시킵니다.
해부 현미경을 사용하여 벌레가 부화했는지 평가하십시오. 현미경 아래에서 10마이크로리터의 S 완충액 방울에 있는 벌레를 세십시오. 카르베니실린, 암포테리신 B 및 OP50을 포함하는 S 완전한 매체에 밀리리터당 60개의 웜이 있는 액체 웜 혼합물을 준비합니다.
웜이 있는 매체 120마이크로리터를 A열에서 G행에 추가하고 웜 매체를 H행에 추가한 다음 오염 및 증발을 방지하기 위해 테이프 밀봉기로 플레이트를 밀봉합니다. 동물이 L4 벌레가 될 때까지 섭씨 20도에서 약 65시간 동안 밀봉된 플레이트를 배양합니다. 30 마이크로리터의 0.6밀리몰 플루오로데옥시우리딘 원액을 각 웰에 첨가하여 L4 단계에서 동물을 멸균합니다.
테이프 실러를 사용하여 플레이트를 다시 밀봉하고 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 800RPM으로 20분 동안 교반합니다. 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 날, 1일차 배양에 관심 약물을 추가합니다.
테이프 실러로 플레이트를 다시 밀봉하고 플레이트 셰이커에서 20RPM에서 800분 동안 흔듭니다. 그런 다음 뚜껑과 밀봉을 제거한 후 플레이트 리더에서 OD600을 1일 측정합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 섭씨 20도 인큐베이터에 다시 넣습니다.
가급적이면 두 배의 대물렌즈를 가진 도립 현미경을 사용하여 각 웰의 지렁이 개체수를 계산하고 스프레드시트에 숫자를 기록합니다. 계산 후 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터로 되돌립니다. 세로토닌 농도의 함수로서 음식 섭취량의 완전한 변화를 나타내는 용량 반응 곡선은 N2 균주가 용량 의존적 방식으로 과식할 수 있음을 보여주었습니다.
daf-16 mu86 돌연변이는 N2보다 더 높은 기초 섭식을 나타냅니다. 그러나 N2 균주와 동일한 용량 의존적 방식으로 세로토닌에 반응할 수 없습니다. 록사핀으로 처리되었지만 X선, 감마선 또는 파라포름알데히드에 의해 사멸된 박테리아를 먹인 지렁이의 먹이 섭취에서 상당한 차이가 관찰되었습니다. 일련의 유전 균주의 음식 섭취량을 비교한 결과, exc-4 및 cgr-1 돌연변이는 덜 먹는 반면 srp-6 돌연변이는 더 많이 먹는 것으로 나타났습니다.
