시작하려면 두 개의 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다. 피펫 50 마이크로 리터 E.coli DnaK756 배양 분취액을 튜브에 넣습니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
10 내지 50 나노그램의 플라스미드 DNA를 대장균 부분 표본과 함께 각 분리된 튜브에 첨가합니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 두십시오. 그런 다음 셀을 섭씨 42도에서 60초 동안 두어 셀에 열 충격을 가합니다.
튜브를 얼음에 10분 동안 다시 넣습니다. 피펫 950 마이크로 리터의 신선한 2 배 효모 트립톤 육수를 튜브에 넣은 다음 섭씨 37도의 셰이커에서 튜브를 배양합니다. 형질전환된 세포 배양액 100마이크로리터를 피펫팅하고 항생제가 함유된 2배 효모 트립톤으로 한천 플레이트에 펼칩니다.
5, 4 섭씨 온도에 000 G에 1 분 동안 세포의 나머지를 분리하십시오. 약 800 마이크로 리터의 국물을 디캔팅합니다. 펠릿화된 세포를 나머지 배지에 재현탁시킵니다.
회수된 세포를 효모 트립톤 한천 플레이트에 두 번 플레이트에 담은 다음 두 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 세포를 도금하려면 멸균 루프를 사용하여 형질전환체에서 단일 콜로니를 선택합니다. 10 밀리리터의 효모 트립톤 육수에 항생제를 넣어 접종한다.
이제 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 100에서 10에서 음의 5 번째까지 세포의 연속 희석액을 준비합니다. 세포를 발견하기 전에 항생제와 IPTG가 보충된 한천 접시를 뚜껑이 부분적으로 열린 상태에서 섭씨 40도의 오븐에 넣습니다. 플레이트가 충분히 건조되면 연속적으로 희석된 세포 2마이크로리터를 한천 플레이트에 놓습니다.
각 샘플을 두 개의 별도 플레이트에 놓습니다. 한 접시는 섭씨 37도의 허용 성장 온도에서, 다른 접시는 섭씨 43.5도의 비허용 성장 온도에서 배양합니다. 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해 멸균 루프를 사용하여 동일한 형질전환체 콜로니에서 나머지 세포의 일부를 픽업합니다.
항생제가 첨가된 효모 트립톤 육수 10mL에 세포를 접종합니다. 섭씨 37도에서 밤새 셰이커에서 배양액을 배양합니다. 모든 대장균 DnaK756 세포는 섭씨 37도의 허용 성장 온도에서 성장했습니다.
그러나, DnaK 및 KPf를 발현하는 이종 세포만이 비허용 성장 온도에서 성장하였다. KPf-V436F를 발현하는 돌연변이세포는 섭씨 37도에서만 성장했고, 섭씨 43.5도에서는 성장하지 못했다.
