SARS-CoV-2에 감염된 Vero E6 세포 상층액에서 SARS-CoV-2 바이러스 입자 검출

먼저 카제인, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 및 BSA를 pH 7과 혼합하여 분석 완충액을 준비합니다. 다음으로, 분석 완충액에 10%토끼 면역글로불린 G를 준비하여 시료 희석 완충액을 만듭니다. 테스트에 필요한 작업 비드 혼합물의 부피를 준비합니다.

그런 다음 준비된 SARS-CoV-2를 해동하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 대조군 상층액을 해동합니다. SARS-CoV-2에 대해 각각 8개의 1.5밀리리터 마이크로퓨지 튜브를 라벨링하고 배열하고 상층액을 대조합니다. 각 상층액의 가장 높은 희석액을 생성하려면 600마이크로리터의 상층액을 적절하게 라벨링된 튜브에 샘플 희석 완충액과 결합한 다음 튜브를 잠시 소용돌이쳐 혼합합니다.

400 마이크로 리터의 1 개의 희석 된 상층액을 다음 희석 튜브로 순차적으로 이송합니다. 다음 희석을 진행하기 전에 희석된 각 상층액을 간략하게 소용돌이칩니다. 그런 다음 30초 동안 볼텍싱한 후 사전 준비된 작업 비드 혼합물을 취하고 바닥이 평평한 384웰 마이크로타이터 플레이트의 할당된 각 웰에 5마이크로리터를 추가합니다.

준비된 상층액 희석액 45마이크로리터를 384웰 플레이트에 마이크로스피어를 포함하는 할당된 웰에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온의 어두운 곳에서 650RPM의 오비탈 쉐이커에서 밤새 배양합니다. 오비탈 쉐이커에서 마이크로타이터 플레이트를 제거한 후 플레이트를 931g에서 1분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 플레이트 실러를 제거합니다. 비드를 고정하려면 마이크로타이터 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 30초 동안 놓습니다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 분리기에 계속 배치한 상태에서 자석이 고정된 비드에서 상층액을 흡입합니다.

자기 분리기에서 마이크로타이터 플레이트를 제거한 후 각 비드 함유 웰에 60마이크로리터의 PBST를 추가합니다. 다음으로, 5개의 1.5밀리리터 튜브를 사용하여 다양한 검출 혼합물을 준비합니다. SARS-CoV-2 입자의 스파이크 단백질을 표적으로 하는 인간 단클론 항-S1 항체 및 FLAG 태그, 단일 사슬 변수 단편을 각 튜브에 추가합니다.

웰당 50마이크로리터의 적절한 단일 사슬, 가변 분절 특이적, 스파이크 검출 혼합물을 세척된 마이크로스피어에 추가합니다. microtiter plate를 밀봉하고 앞서 표시한 대로 배양합니다. 그런 다음 마이크로타이터 플레이트를 원심분리합니다.

비드에서 과도한 스파이크 검출 시약을 60마이크로리터의 PBST로 3회 세척합니다. 다음으로, 21 복합 anti-FLAG 항체용 브릴리언트 바이올렛과 함께 PE-conjugated, anti-human immunoglobulin G로 구성된 형광 용액을 준비합니다. 세척된 마이크로스피어에 형광 용액 혼합물 웰당 50마이크로리터를 추가하고 앞서 표시한 대로 배양합니다.

그런 다음 마이크로타이터 플레이트를 회전시킵니다. 마이크로스피어에서 과도한 형광 용액 혼합물을 60마이크로리터의 PBST로 세척합니다. 마지막 세척 단계에서 60마이크로리터의 PBST에 마이크로스피어를 매달아 놓습니다.

그런 다음 원하는 설정으로 이중 리포터 흐름 분석 시스템에서 플레이트를 분석합니다. 두 리포터 채널에서 SARS-CoV-2에 감염된 세포 상층액의 희석에서 농도 의존적 신호가 관찰되었습니다. 5개의 단일 사슬 변수 단편 중 3개는 1에서 18까지 희석된 바이러스를 검출할 수 있습니다.

나머지 두 개의 단일 사슬 변수 단편에 대해 바이러스는 1에서 6까지의 희석액에서 검출 가능합니다.