텔로미어 길이 측정의 재현성을 확인하기 위한 MMqPCR(Monochrome Multiplex Quantitative PCR) 데이터 분석

텔로미어 길이 측정을 위해 MM QPCR 분석을 수행하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 소프트웨어를 열고 플레이트 설정 기능을 선택합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 보기 또는 플레이트 편집 옵션을 선택합니다.

이제 플레이트의 모든 웰을 강조 표시하십시오. 플로라포어 선택을 클릭합니다. cyber라고 표시된 상자를 선택하고 다른 모든 상자가 선택 취소되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 확인을 클릭하여 확인합니다. 모든 우물에서 강조 표시를 유지하면서 cyber 옆에 있는 load 단어 옆의 상자를 찾아 선택하여 모든 우물에 cyber 레이블을 지정합니다. 이제 표준 대조군 직렬 희석의 상단 또는 하단에 위치한 3개의 비템플릿 대조군 웰을 강조 표시합니다.

그런 다음 오른쪽의 샘플 유형 메뉴에서 NTC를 선택합니다. 표준 제어 직렬 희석을 구성하는 21개의 웰을 강조 표시하고 시료 유형 메뉴에서 표준물질을 선택합니다. 이러한 웰이 여전히 선택되어 있는 동안 기술 복제를 클릭하고 복제 크기 메뉴에서 3을 선택합니다.

그런 다음 horizontal을 선택하고 apply를 클릭합니다. 그런 다음 dilution series 섹션까지 아래로 스크롤하여 dilution factor 필드에 2를 입력합니다. P1 플레이트의 경우 시작 농도 필드에 음수 3의 거듭제곱에 2 곱하기 10을 입력합니다.

그런 다음 감소 상자를 선택하고 적용을 클릭하여 설정을 확인합니다. P2 플레이트의 경우, 시작 농도 필드에 음수 5의 거듭제곱에 3.13 곱하기 10을 입력합니다. 증가 확인란을 선택한 다음 적용을 선택하여 설정을 완료합니다.

이제 시료 유형 메뉴에서 PCR 스트립 A에 해당하는 열을 강조 표시하고 unknown을 선택한 다음 technical replicate를 선택합니다. replicate size(복제 크기) 메뉴에서 3개를 선택하고 horizontal(수평)을 선택한 후 apply(적용)를 클릭합니다. 플레이트 편집기 창의 오른쪽 하단에 있는 확인을 클릭합니다.

메시지가 표시되면 yes(예)를 클릭하여 변경 사항을 확인합니다. 다음으로, 정량화 탭의 곡선이 9단계와 12단계 모두에 적합한지, 이 두 단계 간의 효율성 값이 10% 이상 차이가 나지 않는지 확인합니다. P1의 경우 9단계를 선택하고 표준 곡선에 해당하는 21개의 웰을 강조 표시합니다. 소프트웨어 창의 오른쪽 하단 모서리에서 CQ 값을 복사합니다.

그런 다음 Telomere 데이터 시트 템플릿을 열고 이 값을 표준 한 시트 열 B에 붙여넣습니다.그런 다음 표준 한 시트의 C 4 셀에 9단계의 기울기 값을 입력하고 각 표준 희석 삼중 항목에 대한 변동 계수가 0.1 미만인지 확인합니다. CFX에서 삼중 집합이 범위를 벗어나게 하는 이상치 데이터 포인트를 분석에서 제외합니다. 이제 P1 분석 파일의 72개 시료 웰만 정량화 탭에서 파란색으로 강조 표시되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 9단계에서 소프트웨어 창의 오른쪽 아래 모서리에 있는 CQ 및 SQ 값을 복사하여 D3 셀에서 시작하는 샘플 P1 시트에 붙여넣습니다. CFX maestro를 사용하여 분석 샘플의 모든 CQ 값이 표준 곡선의 가장 낮은 CQ 값과 가장 높은 CQ 값 범위 내에 있는지 확인합니다. Excel 시트에서 NTC의 시작 농도가 샘플 웰에 있는 평균 DNA 양의 5% 미만인지 확인합니다. 시료 수준 품질 관리를 위해 시료 P1 및 P2 시트의 J 및 K 열에서 표준 편차와 변동 계수를 검사합니다.

P1 대 P2 시트, 특히 G열의 개별 샘플 인터플레이트 CV가 0.05를 초과하지 않는지 확인합니다. 샘플의 interplate CV가 허용 가능한 것보다 높으면 각 샘플에 대한 계산에서 최대 1개의 트리플리케를 제거합니다. 플레이트 수준 품질 관리를 위해 각 플레이트의 모든 샘플에서 평균 플레이트 간 변동이 0.05 미만인지 확인하십시오.

샘플의 interplate CV가 허용 가능한 것보다 높으면 각 샘플에 대한 계산에서 최대 1개의 트리플리케를 제거합니다. 추가적인 플레이트 레벨 품질 관리를 위해 P1 대 P2 시트의 전체 플레이트 간 변동이 0.06 미만인지 확인하십시오.