Two-Photon Microscopy를 사용한 신생아 마우스의 단일 세포 수준 활성 이미징

시작하려면 티타늄 플레이트가 있는 2축 고니오미터를 스테이지 플레이트에 부착하여 현미경에서 XY 위치를 지정합니다. 스캐닝 소프트웨어를 활성화하고 픽셀을 512 x 512 양방향으로 설정하고 20X 대물 렌즈를 사용합니다. 두개골 창 수술을 시행한 후 GCaMP를 발현하는 강아지를 가열 패드의 반구 한쪽에 놓습니다.

나사를 사용하여 헤드 마운트 티타늄 바를 티타늄 플레이트에 고정합니다. 그런 다음 고니오미터로 창 각도를 수평으로 조정합니다. 백라이트로 뇌 표면을 비추고 5X 대물 렌즈로 XY 포지셔닝을 사용하여 이미징 영역을 선택합니다.

20X 수침 렌즈 아래에서 두개골 창에 안약을 투여합니다. 백라이트를 비활성화한 후 하나의 광자 모드에서 뇌 표면을 스캔합니다. 레이저 강도를 높여 유리와 뇌 표면에서 녹색 자가형광을 시각화합니다.

외부 빛 간섭을 방지하기 위해 현미경을 덮으십시오. 이미징을 위해 스캐닝 소프트웨어를 2광자 모드로 시작합니다. 그런 다음 레이저 출력과 검출기 게인을 보정하여 GCaMP 신호를 최적으로 시각화합니다.

GCaMP 발현 뉴런이 많이 채워진 이미징 영역에서 깊이를 찾고 타임랩스 이미징을 시작하여 GCaMP 신호를 캡처합니다. 2광자 현미경 검사는 녹색 형광을 가진 출생 후 6일째 되는 새끼의 배럴 피질에서 4층 뉴런 활동을 밝혀냈습니다. 녹색 GCaMP가 더 두드러져 빨간색 채널로 신호가 누출되고 14개의 관심 영역이 식별되었습니다.