RNA 염기서열분석을 위한 균질화된 인간 근육 간 지방 조직 샘플에서 단일 세포 핵 분리

균질화된 인간 근육 간 지방 조직을 얼음 위의 1.7밀리리터 로우 바인드 튜브에 수집한 후 14마이크로리터의 10% Triton X-100을 균질액에 추가합니다. 튜브를 어두운 얼음 위에서 10-15분 동안 배양하면서 3분마다 소용돌이칩니다. 별도의 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 100 마이크로리터의 DPBS로 100 미크론 셀 스트레이너 1개와 40미크론 셀 스트레이너 1개를 미리 적십니다.

100미크론 셀 스트레이너를 통해 균질액을 여과합니다. 1.7 밀리리터의 로우 바인드 튜브를 400 마이크로리터의 균질화 버퍼로 헹구고 현탁액을 100 미크론 세포 여과기까지 여과합니다. 다음으로, 100미크론 여과액을 통해 얻어진 현탁액을 40미크론 셀 스트레이너에서 여과합니다.

용액을 두 개의 사전 냉각된 1.7밀리리터 로우 바인드 튜브에 고르게 분배합니다. 섭씨 2700도에서 10분 동안 4G의 튜브를 원심분리합니다. 상단 지질층과 상층액을 버리고 첫 번째 튜브에 약 50마이크로리터를 남깁니다.

첫 번째 튜브에 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 새로운 1.7밀리리터 로우 바인드 튜브로 옮기기 위해 기포를 생성하지 않고 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 다음으로, 500 마이크로리터의 핵 분리 매체를 1.7 밀리리터의 로우 바인드 튜브에 추가하고 피펫팅과 혼합합니다. 섭씨 1000도에서 10분 동안 튜브를 4G로 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 튜브와 피펫에 약 50마이크로리터를 남겨 펠릿을 부유시키도록 부드럽게 합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 핵 분리 매체를 추가하고 현탁액을 혼합합니다. 살아있는 세포 염색 용액 한 방울을 넣고 얼음 위의 어두운 곳에서 배양합니다.

15분 후 30미크론 셀 스트레이너를 통해 용액을 여과합니다. 핵 용액을 혼합하고 세포 계수 챔버 슬라이드에 10마이크로리터를 추가합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 핵을 계수합니다.